Die Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante ist sensitiver gegenüber oxidativem Stress als E. coli

Eisen/Mangan-Aufnahme-0 1 2 3 4 5

0 20 40 60

Paraquat (Methylviologen) [µM]

OD [600 nm]

Mutante durch vorherige Inkubation der Kulturen mit Mangan bzw. Eisen beeinflusst werden.

Wurden die Zellen mit MnCl2 inkubiert, so resultierte dies in einer verstärkten Resistenz gegenüber Trockenstress. Wurden jedoch die Zellen mit FeCl3 angezogen, so war die Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante sensitiver gegenüber Trockenstress.

3.2.4. Die Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante ist sensitiver gegenüber oxidativem

100 150 200 250 300

0 1 2 3 4 5

Zeit [h]

Klett Einheiten

Wachstum der Kultur, die ohne Zusatz und ohne Paraquat inkubiert wurde. Dabei verdoppelte sich die Zellzahl bis zum Erreichen der stationären Phase. Eine Inkubation der Vorkulturen mit FeSO4 veränderte nicht die Sensitivität der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante gegenüber Paraquat, hier konnte nach Zugabe von Paraquat kein Wachstum beobachtet werden. Diese Kultur verhielt sich genauso wie die Kultur, die ohne Zusätze zuvor inkubiert wurde. Wurde zu den Kulturen, die zuvor mit Mangan oder Eisen inkubiert wurden, keine Paraquat hinzu gegeben, so konnten die Ergebnisse der zeitabhängigen Wachstumsexperimente bestätigt werden (Abb.

15), denn ein Zusatz dieser Metalle verbesserte das Wachstum der Aufnahme-Mutante. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Mangan, nicht Eisen, die Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante vor Paraquat-induziertem oxidativen Stress schützen kann.

Abb. 18: Wachstum in Anwesenheit von Mangan erhöht die Resistenz gegenüber Paraquat-vermittelten oxidativem Stress der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante

Die Anzucht der Vor- und Mittelkulturen erfolgte wie unter Abb. 15 beschrieben. Die Mittelkulturen wurden 1:400 in Tris-MM ohne Eisen, mit desferriertem CAS verdünnt und mit 10 µM FeSO4 (Vierecke), mit 10 µM MnCl2 (Dreiecke) oder ohne Zusatz (Kreise) inkubiert. Das Zellwachstum erfolgte bei 37°C bis zum Erreichen von 100 Klett-Einheiten. Die Kulturen wurden gewaschen, auf dieselbe Zelldichte eingestellt und in zwei Ansätze aufgeteilt. Zu einem Ansatz wurde 150 µM Paraquat hinzugegeben (volle Symbole), der andere blieb unbehandelt (leere Symbole). Das weitere Wachstum wurde mit einem Klett-Summerson-Colorimeter verfolgt. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen von mindestens drei unabhängigen Messungen.

3.2.4.2. Die Manganhaltige Superoxid-Dismutase SodA scheint für den aeroben Metabolismus der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante essenziell zu sein

E. coli besitzt drei verschiedene Superoxid-Dismutasen, die sich u. a. in ihren Kofaktoren unter-scheiden. Die manganhaltige (SodA)- und die eisenhaltige (SodB)-Superoxid-Dismutase sind im Cytoplasma lokalisiert, wohingegen SodC, die kupfer- und zinkhaltige Superoxid-Dismutase, im Periplasma lokalisiert ist (Fridovich, 1995; Imlay und Imlay, 1996; Miller, 2004). Die Superoxid-Dismutasen, insbesondere die cytoplasmatischen Enzyme SodA und SodB, übernehmen in E. coli eine wichtige Funktion im Schutz vor reaktiven Sauerstoffspezies.

Um zu erörtern, ob das durch Mangan hervorgerufene, verbesserte Wachstum der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante mit einer erhöhten SodA-Aktivität im Zusammenhang steht, wurden die Superoxid-Dismutasen-Aktivitäten in Kulturen der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante und des E. coli Wildtyps unter verschiedenen Wachstumsbedingungen untersucht. Stammte die

+ Paraquat/FeSO4

+ FeSO4

ohne Zusatz + MnCl2

+ Paraquat/MnCl2

+ Paraquat

Proteinfraktion vom E. coli Wildtyp, der in Anwesenheit von DIP oder MnCl2 inkubiert worden war, so konnten große Mengen aktiver MnSOD (SodA) und nur geringe Mengen aktiver FeSOD (SodB) nachgewiesen werden (Abb. 19). Wurde der E. coli Wildtyp W3110 mit Eisen oder mit Eisen und Mangan inkubiert, so konnten ähnliche Aktivitäten von SodA und SodB beobachtet werden, wobei die SodA-Aktivität, im Vergleich zur Anzucht mit Mangan bzw. DIP, ab- und die SodB-Aktivität zunahm. Unter Eisenlimitation konnten in Zellen der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante nur sehr geringe SodA-Aktivitäten und keine SodB-Aktivitäten nachgewiesen werden.

Abb. 19: Die SodA-Aktivität der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante kann durch Manganzugabe stark gesteigert werden Die Anzucht und Inkubation der E. coli Stämme erfolgte wie unter Abb. 15 beschrieben. Lösliche Proteinfraktionen wurden aus E. coli Wildtyp- und ECA458-Kultur gewonnen, die mit 2.5 µM DIP, 10 µM MnCl2, 10 µM FeSO4 oder mit 10 µM MnCl2 und 10 µM FeSO4 inkubiert wurden. Diese Proteinfraktionen wurden in einer 12.5%igen Nativen PAGE aufgetrennt. Das Gel wurde 20 min im Dunkeln in 12.5 mg Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT) und 5 mg Riboflavin, gelöst in 50 ml H2Obidest., inkubiert. Die Radikalreaktion wurde durch Zugabe von 150 µl TEMED gestartet. Gezeigt ist ein repräsentatives Beispiel dreier Wiederholungen des Experimentes.

Durch Zugabe von 10 µM MnCl2 zum Medium konnte eine gesteigerte SodA-Aktivität in der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante beobachtet werden, jedoch keine SodB-Aktivität. Durch Inkubation der Kultur mit 10 µM FeSO4 konnte SodB, aber auch SodA, anhand der Aktivitätsfärbung nachgewiesen werden. Inkubierte man die Kulturen mit beiden Metallen, so konnten beide Superoxid-Dismutasen detektiert werden, dabei überwiegte die SodA-Aktivität im Vergleich zur SodB-Aktivität. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante (ECA458) nicht mehr in der Lage ist, genauso viel aktive Superoxid-Dismutasen zu bilden wie E. coli Wildtyp, jedoch kann durch Zugabe des entsprechenden Metall-Kofaktors die Aktivität erhöht werden. Unter diesen Bedingungen konnten vergleichbare Aktivitäten der SodA in der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante und im Wildtyp beobachtet werden. Die SodB-Aktivität konnte zwar gesteigert werden, erreichte aber nicht die SodB-Aktivität des Wildtyps. Die Ergebnisse des Zymogramms lassen die Notwendigkeit der manganhaltigen

Superoxid-Dismutase zum Schutz vor reaktiven Sauerstoffverbindungen in der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante vermuten.

Die besondere Rolle von SodA in dieser Mutante wurde durch weiterführende Experimente deutlich. So konnte eine zusätzliche Deletion von sodA in der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante nur unter anaeroben Bedingungen erfolgreich erzielt werden (Abb. 20B). Wurden diese Deletionsmutanten (Abb. 20A) aerob inkubiert, so konnte kein homogenes Wachstum, sondern große und kleine Koloniemorphologien, beobachtet werden. Das Wachstum dieser Deletions-mutante [ECA585 (ΔfecA-E ΔfeoABC ΔmntH ΔzupT ΔentC ΔsodA::kan)] schien unter aeroben Bedingungen stark beeinträchtigt zu sein. Im Gegensatz dazu konnte im E. coli Wildtyp diese Deletionsmutante unter aeroben Bedingungen ohne Probleme konstruiert werden (Daten nicht gezeigt).

Abb. 20: SodA scheint unter aeroben Wachstumsbedingungen in der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante essenziell zu sein

Nach zusätzlicher Deletion von sodA bzw. sodB in der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante wurde der E. coli Stamm ECA 585(ΔfecA-E ΔfeoABC ΔmntH ΔzupT ΔentC ΔsodA::kan) unter Eisenlimitation aerob (A) und anaerob (B) inkubiert. Das gleiche Experiment wurde mit dem E. coli Stamm ECA586(ΔfecA-E ΔfeoABC ΔmntH ΔzupT ΔentC ΔsodB::kan)] aerob (C) oder anaerob (D) durchgeführt. Anaerobe Platten wurden bei 37°C für zwei Tage und aerobe bei 37°C für einen Tag inkubiert. Gezeigt ist ein repräsentatives Beispiel dreier Wiederholungen des Experimentes.

Eine Deletion des Gens der eisenabhängigen Superoxid-Dismutase SodB in der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante war sowohl unter anaeroben als auch unter aeroben Wachstumsbedingungen möglich und wurde nach erneuter aerober (Abb. 20C) bzw. anaerober (Abb. 20D) Inkubation nicht beeinflusst. Dies konnte ebenfalls für die Deletion von sodB in E. coli W3110 beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse bestätigen die Notwendigkeit der mangan-haltigen Superoxid-Dismutase SodA in der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante unter aeroben Bedingungen.

In einem weiterführenden Experiment wurde untersucht, ob ein Zusatz von Mangan nicht doch das Wachstum einer sodA Deletionsmutante unter aeroben Bedingungen ermöglicht. Wie in Abbildung 21A und B gezeigt werden kann, erlaubt bereits die Zugabe von 10 µM MnCl2 ein aerobes Wachstum der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante, die zusätzlich in sodA deletiert wurde.

A: B: C: D:

sodA-Mutanten sodB-Mutanten

aerob anaerob aerob anaerob

Eisen dagegen ermöglichte nicht das Wachstum dieser Mutante, auch eine Erhöhung der Konzentration auf 100 µM FeSO4 führte nicht zum aeroben Wachstum dieses E. coli Deletionsstammes (Abb. 21C und D).

Abb. 21: Mangan ermöglicht das aerobe Wachstum der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante mit zusätzlicher sodA Deletion

Nach zusätzlicher Deletion von sodA in der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante wurde der E. coli Stamm ECA 585(ΔfecA-E ΔfeoABC ΔmntH ΔzupT ΔentC ΔsodA::kan) unter Eisenlimitation aerob in Anwesenheit von 10 µM MnCl2

(A), 100 µM MnCl2 (B), 10 µM FeSO4 (C) oder 100 µM FeSO4 (D) über Nacht bei 37°C inkubiert. Gezeigt ist ein repräsentatives Beispiel dreier Wiederholungen des Experimentes.

3.2.5. Auch das anaerobe Wachstum der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante kann