3. ERGEBNISSE
3.2. Neue Zusammenhänge zwischen Mangan-und Eisen-Homöostase in Escherichia coli
3.2.6. Die Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante ist sensitiver gegenüber dem Fe(III)-Antagonist Gallium
Durch den Einsatz von Gallium kann extreme Eisenlimitation simuliert werden (Kaneko et al., 2007). Was geschieht, wenn Zellen, die ständig Eisenmangel ausgesetzt sind, wie die der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante, in Anwesenheit von Gallium angezogen werden? Um dies zu untersuchen, wurde die Minimale Inhibitor-Konzentration (MIC) der Mutante und des E. coli Wildtyps in Flüssigkulturen bestimmt.
In Abbildung 23A ist zu erkennen, dass die Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante in Wachstums-Endpunktbestimmungen sensitiver gegenüber Gallium war als der Wildtyp und eine MIC von 13 µM Ga(NO3)3 besaß. Die genaue Minimale Inhibitor-Konzentration für E. coli Wildtyp konnte nicht bestimmt werden, da Ga(NO3)3 in hohen Konzentrationen in Tris-MM präzipitierte. Die MIC liegt jedoch jenseits von 200 µM Ga(NO3)3. Um zu untersuchen, ob durch Zugabe von Mangan oder Eisen die Wachstums-Inhibierung durch Gallium wieder aufgehoben werden kann, wurden Wachstums-Endpunktbestimmungen in Anwesenheit von 13 µM Ga(NO3)3 und gleichzeitiger Titration steigender Konzentrationen von MnCl2, FeSO4 oder FeCl3 (Abb. 23B) durchgeführt.
Dabei konnte beobachten werden, dass schon geringe MnCl2-Konzentrationen (0.25 µM) zum Wachstum der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante in Gegenwart von Gallium genügten. Wurde
0 1 2 3 4
0 10 20 30 40 50
Ga(NO3)3
OD [600 nm]
0 1 2 3
0 2 4 6 8
13 µM Ga(NO3)3 + Metall [µM]
OD [600 nm]
Eisen hinzu titriert, musste 4-fach höhere Konzentrationen an FeSO4 bzw. 8-fach mehr FeCl3
eingesetzt werden, um ein ähnliches Wachstumsverhalten der E. coli Mutante wie in Gegenwart von Gallium und MnCl2 erzielen zu können. Interessanterweise förderte die Zugabe höherer Konzentrationen von FeSO4, jedoch nicht von MnCl2, das Wachstum der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante, wodurch ansteigende Optische Dichten nach 24-stündiger Inkubation erzielt wurden.
A: B:
Abb. 23: Gallium inhibiert das Wachstum der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante stärker als das des Wildtyps; sowohl Eisen- als auch Manganzugabe kann die Wachstums-Inhibierung durch Gallium aufheben
Die Anzucht der Vor- und Mittelkulturen erfolgte wie unter Abb. 15 beschrieben jedoch in Tris-MM. Die Mittelkulturen der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante (
□
) und des E. coli Wildtyps W3110 (■
) wurden 1:400 in Tris-MM und steigenden Ga(NO3)3-Konzentrationen verdünnt (A). In (B) wurde die Mittelkultur der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante 1:400 in Tris-MM mit 13 µM Ga(NO3)3 und steigenden Konzentrationen von MnCl2 (▲
), FeSO4 (■
) oder FeCl3 (◇
) verdünnt.Nach 24-stündiger Inkubation bei 37°C erfolgte die Bestimmung der OD [600 nm]. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen von mindestens drei unabhängigen Messungen.
Als Kontrolle wurden Wachstums-Endpunktbestimmungen in Anwesenheit von 13 µM Ga(NO3)3
und steigenden Konzentrationen von ZnCl2 durchgeführt. Durch Zink-Zugabe konnte jedoch kein Wachstum der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante erzielt werden (Daten nicht gezeigt). Sowohl Mangan als auch Eisen konnten im unterschiedlichen Maße spezifisch die Wachstums-Inhibierung durch Gallium wieder aufheben. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass das Zusammenspiel von Gallium und Eisen-Homöostase komplexer ist als bisher angenommen.
3.2.6.1. Gallium verringert nicht den intrazellulären Eisengehalt in Zellen der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante und des E. coli Wildtyps
Weshalb inhibiert Gallium das Wachstum der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante? Blockiert es die noch vorhandenen, unbekannten Eisen-Aufnahme-Systeme und verstärkt so Eisenlimitation, so wie es für Pseudomonas aeruginosa nachgewiesen wurde (Kaneko et al,. 2007)? Oder wirkt Gallium als Fe-Substituent vorwiegend intrazellulär? Um dies zu untersuchen, wurde der intrazelluläre Gallium-und Eisengehalt von Zellen der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante und des E. coli Wildtyps, die mit verschiedenen Gallium-Konzentrationen inkubiert wurden, bestimmt.
Dazu wurden Gallium-Konzentrationen gewählt, in deren Anwesenheit noch Wachstum der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante zu beobachten war. In Abbildung 24 ist das Wachstum der
0 50 100 150 200 250 300
0 5 10 15 20
Zeit [h]
Klett Einheiten
Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante und des E. coli Wildtyps in Tris-MM ohne Gallium und in Anwesenheit von 2, 4 oder 6 µM Ga(NO3)3 gezeigt.
Wie schon vorangegangene Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, ist die Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante gegenüber Gallium sensitiver als der E. coli Wildtyp. Schon die Anwesenheit von 2 µM Ga(NO3)3 verminderten das Wachstum der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante. In Gegenwart von 4 oder 6 µM Ga(NO3)3 wurde das Wachstum zwar zunehmend vermindert, erfolgte jedoch noch.
Bei diesen Konzentrationen sollte sich also Galiumstress gut untersuchen lassen. Das Wachstum des E. coli Wildtyps wurde in Anwesenheit dieser Gallium-Konzentrationen nicht beeinflusst. Zur Bestimmung des intrazellulären Gallium- bzw. Eisengehaltes wurden stationäre Zellen beider E. coli Stämme, deren Wachstum ohne Zusatz und mit 2, 4 oder 6 µM Ga(NO3)3 erfolgte, geerntet, gewaschen und der Metallgehalt in 108 Zellen in der Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry (ICP-MS) bestimmt. In Abbildung 25A ist ersichtlich, dass sowohl in E. coli Wildtyp-Zellen als auch in Wildtyp-Zellen der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante die intrazelluläre Gallium-Konzentration zunimmt, wenn diese mit steigenden Gallium-Gallium-Konzentrationen inkubiert wurden.
Jedoch war der intrazelluläre Galliumgehalt in Zellen der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante um ca. ein Drittel geringer als in E. coli Wildtyp-Zellen. Darüber hinaus veränderte sich der intrazelluläre Galliumgehalt in Zellen der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante, die mit 4 oder 6 µM Ga(NO3)3 inkubiert wurden, nur wenig. Hier wurden ca. 1.6 und 1.86 ng Ga/108 Zellen nach-gewiesen. In Zellen des E. coli Wildtyps dagegen konnte eine eindeutige Erhöhung des Galliumgehaltes unter diesen Bedingungen festgestellt werden, hier betrug der intrazelluläre Galliumgehalt in 108 Zellen ca. 3 und 4.5 ng. Da in Zellen des E. coli Wildtyps mehr Gallium nachgewiesen wurde als in Zellen der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante, wird die Annahme bestärkt, dass Gallium über Eisen-Aufnahme-Systeme in die Zelle gelangen könnte. Um zu untersuchen, ob Gallium die Eisen-Aufnahme beeinflusst, wurde ebenfalls der intrazelluläre Eisengehalt dieser Zellen bestimmt. Dabei wurden vorangegangene Ergebnisse bestätigt, denn der intrazelluläre Eisengehalt in Zellen der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante war stets geringer ist als der Eisengehalt in Zellen des E. coli Wildtyps (Abb. 25B).
Abb. 24: Bereits geringe Gallium-Konzentrationen hemmen das Wachstum der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante Die Anzucht der Vor- und Mittelkulturen erfolgte wie unter Abb. 23 beschrieben. Die Mittelkulturen der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante (leere Symbole) und des E. coli Wildtyps (volle Symbole) wurden 1:400 in 10 ml Tris-MM verdünnt und ohne Zusatz (□, ■), mit 2 µM Ga(NO3)3 (
△
,▲
), mit 4 µM (∘
,∙
) oder 6 µM Ga(NO3)3 (◇
;◆
) inkubiert. Das Zellwachstum erfolgte bei 37°C und wurde kontinuierlich bis zum Erreichen der stationären Phase mit einem Klett-Summerson-Colorimeter verfolgt. Dargestellt sind die Mittel-werte von mindestens drei unabhängigen Messungen.0 20 40 60
0 2 4 6
Ga(NO3)3 [µM]
ng Fe/108 Zellen 0
1 2 3 4 5 6
0 2 4 6
Ga(NO3)3 [µM]
ng Ga/108 Zellen
A: B:
Abb. 25: Gallium beeinflusst nicht den intrazellulären Eisengehalt stationärer Zellen der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante
Nach erfolgtem Wachstum der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante (□) und des E. coli Wildtyps (■) in Gegenwart von 0, 2, 4 oder 6 µM Ga(NO3)3 wurden die Kulturen in der stationären Phase geerntet, gewaschen und von 108 Zellen der (A) intrazelluläre Galliumgehalt und (B) intrazelluläre Eisengehalt durch ICP-MS bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen von mindestens drei unabhängigen Messungen.
Zudem beeinflusste eine Inkubation mit Gallium den intrazellulären Eisengehalt in stationären Zellen der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante nicht und betrug ca. 22 ng Fe/108 Zellen. Dagegen wurde in Anwesenheit von 6 µM Ga(NO3)3 in Zellen des E. coli Wildtyps mit etwa 53 ng ein um ca. die Hälfte erhöhter Eisengehalt festgestellt als in Zellen, die ohne Gallium inkubiert wurden, hier wurden ca. 36 ng Fe/108 Zellen ermittelt.
Diese Daten deuten darauf hin, dass die durch Gallium hervorgerufene Wachstums-Inhibition der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante nicht durch eine verminderte Eisen-Aufnahme verursacht wird.
Jedoch scheint es einen Zusammenhang zwischen einem verminderten intrazellulären Eisen-gehalt und erhöhter Sensitivität gegenüber Gallium zu geben.
3.2.6.2. Gallium führt zu einer verminderten FeSOD (SodB)-Aktivität in der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante
In Beriault et al. (2007) wurde erstmalig Gallium-induzierter oxidativer Stress in Pseudomonas fluoreszenz beschrieben. Um zu untersuchen, ob die wachstumsinhibierende Wirkung von Gallium in der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante durch oxidativen Stress verursacht wird, wurde die Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante in Tris-MM ohne Gallium bzw. mit 2, 4 oder 6 µM Ga(NO3)3 bis 100 Klett inkubiert, anschließend lösliche Proteinfraktionen präpariert und die SOD-Aktivitäten im Zymogramm untersucht. Wie in Abbildung 18, konnten auch hier im Vergleich zum E. coli Wildtyp nur geringe Mengen aktiver Superoxid-Dismutasen in der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante beobachtet werden (Abb. 26). Des Weiteren ist bemerkenswert, dass in Proteinfraktionen von Zellen der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante, die mit 4 oder 6 µM Ga(NO3)3 inkubiert wurden, kaum noch aktive FeSOD (SodB) nachgewiesen werden konnte.
Im Gegensatz dazu wurden ähnliche, jedoch geringe MnSOD (SodA)-Aktivitäten in jeder Proteinfraktionen beobachtet. In Zellen des E. coli Wildtyps konnten ähnliche SOD-Aktivitäten nachgewiesen werden, unabhängig davon, ob E. coli Wildtyp-Zellen mit oder ohne Gallium inkubiert wurden.
Abb. 26: Gallium führt zu einer verringerten SodB-Aktivität in Zellen der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante, jedoch nicht in E. coli Wildtyp-Zellen
Die Anzucht und die Inkubation der E. coli Stämme erfolgte wie unter Abb. 22 beschrieben bis 100 Klett-Einheiten.
Lösliche Proteinfraktionen wurden aus E. coli ECA458- bzw. Wildtyp-Kultur gewonnen, die ohne Zusatz, mit 2, 4 oder 6 µM Ga(NO3)3 inkubiert wurden und in einer 12.5%ige Nativen PAGE aufgetrennt. Das Gel wurde 20 min im Dunkeln in 12.5 mg NBT und 5 mg Riboflavin, gelöst in 50 ml H2Obidest., inkubiert. Die Radikalreaktion wurde durch Zugabe von 150 µl TEMED gestartet. Gezeigt ist ein repräsentatives Beispiel dreier Wiederholungen des Experimentes.
Diese Ergebnisse zeigen, dass steigende Gallium-Konzentrationen in der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante zu einer verminderten und letztendlich, in Anwesenheit von 6 µM Ga(NO3)3,
zum Verlust einer aktiven SodB führte. Die Folgeerscheinung ist wahrscheinlich zunehmender oxidativer Stress in diesen Zellen. Dies könnte eine mögliche Ursache für das inhibierte Wachstum der Eisen/Mangan-Aufnahme-Mutante in Anwesenheit von Gallium darstellen.