Im Gegensatz zum Biotintransporter Vht1p spielt die Biotin-Protein-Ligase Bpl1p eine wichtige, wenn auch vermutlich indirekte Rolle bei der Biotinmangelantwort, denn eine normale Aktivität
der Bpl1p ist essentiell für eine korrekte Biotinwahrnehmung. Ist die Aktivität der Bpl1p verringert – durch das Einführen einer Mutation oder durch Reduktion der Enzymmenge – wird auch bei normalen Biotinbedingungen das Biotinmangelsignal erzeugt (vgl. Kapitel 3.2.3).
In E. coli besitzt die bifunktionelle Biotin-Protein-Ligase BirA neben der Carboxylierungsaktivität eine Funktion in der Regulation des Biotinmetabolismus (vgl. Kapitel 1.2.7). Bei Biotinüberschuss oder einem Mangel an Apo-BCCP (BCCP ist das einzige Biotinakzeptorprotein in E. coli) akkumuliert in den Zellen die aktivierte Form von BirA, der Biotinyl-5´-AMP-BirA-Komplex, und dimerisiert. Über die N-terminale Domäne von BirA bindet dieser aktivierte Enzymkomplex an einen 40 bp Biotinoperator in der Promotorregion des Biotinbiosyntheseoperons und blockiert die Initiation der Transkription der Biotinbiosynthesegene. Häuft sich Apo-BCCP aufgrund Biotinmangels oder verstärkter BCCP-Expression an, wird Biotin auf das Apo-BCCP übertragen, der Biotinyl-5´-AMP-Enzymkomplex aufgelöst und die Operatorbindung von BirA verhindert.
Auch wenn die N-terminale Domäne der S. cerevisiae Bpl1p ähnlich wie bei BirA für die Aktivität des Enzyms wichtig ist, besitzt sie andererseits wie alle eukaryotischen BPLs keine DNA-Bindefunktion [Polyak et al., 1999; Alban, 2000]. Außerdem wird wahrscheinlich das Biotinsystem in S. cerevisiae, im Gegensatz zu E. coli, durch einen Aktivator reguliert (vgl.
Kapitel 4.1). Gegen eine direkte Rolle der Bpl1p in der Regulation der Biotingene spricht auch, dass Bpl1p aus S. pombe mit einer Proteinverwandtschaft zu Bpl1p aus S. cerevisiae von nur 33 % in einer S. c. bpl1Δ-Mutante nicht nur die Biotinylierungsfunktion übernehmen kann, sondern dieser Stamm damit auch fähig ist die Biotinmangelantwort einzuleiten (Daten nicht gezeigt).
Zellen mit reduzierter BPL1-Expression und aktiviertem Biotinsystem (GAL-BPL1-Zellen nach Anzucht in Glukose) besitzen in etwa die gleiche Konzentration an intrazellulärem freien Biotin wie die GAL-BPL1-Zellen bei induzierter BPL1-Expression. Gegenüber WT-Zellen unter normalen Bedingungen ist diese sogar etwa 2x erhöht. Dagegen haben Zellen aus Niedrig-Biotinmedium mit induzierter Biotinmangelantwort eine geringe intrazelluläre Konzentration an freiem Biotin (vgl. Tab. 3-1, Seite 62). Somit ergibt sich kein Zusammenhang zwischen cytoplasmatischer Konzentration an freiem Biotin und dem Signal für die Expressionssteigerung der biotinabhängig regulierten Gene.
Eine Gemeinsamkeit von Zellen mit aktivierter Biotinmangelantwort (Zellen aus Niedrig-Biotinmedium, vht1Δ-Mutanten und Zellen mit reduzierter Bpl1-Aktivität) ist dagegen ihre stark verringerte Proteinbiotinylierung, die bei allen biotintragenden Proteinen auffällt.
Eine mögliche Erklärung für die Wechselbeziehung zwischen Aktivität der Bpl1p und Regulation der Expression der Biotingene ist, dass die verminderte Aktivität eines biotinabhängigen Enzyms unter Bedingungen mit reduzierter Proteinbiotinylierung das Biotinmangelsignal auslöst. Das
auslösende Signal könnte alternativ der mit reduzierter Proteinbiotinylierung einhergehende Mangel an Metaboliten sein. Beide Möglichkeiten können aber weitgehend ausgeschlossen werden, denn weder ein Absenken der Aktivität des essentiellen Enzyms Acc1p und der vermutlich damit einhergehenden Reduktion der Malonyl-CoA- und Fettsäuremenge in den Zellen noch die Deletion eines Gens der anderen biotintragenden Enzyme rufen eine erhöhte Reportergenexpression hervor (vgl. Kapitel 3.2.4). Die Zugabe von Fettsäuren zum Nährmedium verringert andererseits zwar die absolute Reportergenexpression in WT-Zellen, verhindert aber kein Biotinmangelsignal und kann auch hier mit einer Reduktion der Acc1p-Menge erklärt werden (vgl. Abb. 3-18 und 3-22). Dazu beobachtet man im Falle einer bpl1-Mutation trotz Fettsäurezusatz sogar unter Normal-Biotinbedingungen hohe Expressionslevel des Reportergens (vgl. Abb. 3- 18).
Nach Deletion beider Pyruvatcarboxylasegene wird von S. cerevisiae-Zellen keine Biotinmangelantwort mehr initiiert (vgl. Abb. 3-24; Tab. 3-2, Seite 77; Abb. 3-25 und 3-26). Hier muss man zwar berücksichtigen, dass den Pyc-Doppeldeletionsmutanten zum Wachstum Aspartat zugesetzt wurde, das von den Zellen zu Oxalacetat, dem Stoffwechselprodukt der Pyruvatcarboxylasen, umgesetzt werden kann. Andererseits kann der WT-Stamm unter den gleichen Bedingungen eine normale Biotinregulation durchführen und eine Verringerung der Aspartat-Konzentration im Medium ändert nichts an dem Verlust der Biotinmangelantwort von Pyc-Doppeldeletionsmutanten (Daten nicht gezeigt).
Denkbar ist auch, dass von den Zellen der Biotinylierungsgrad eines der Biotinproteine wahrgenommen wird. Hier ist interessant, dass bei Mutanten, bei denen die Gene einzelner biotintragender Proteine deletiert bzw. herabreguliert sind, die Biotinmangelantwort noch möglich ist, wenngleich sie meist deutlich geringer ausfällt als beim WT-Stamm. Obwohl ein Sensorprotein eventuell auch mit mehreren biotintragenden Proteinen, selbst in unterschiedlichen Kompartimenten (Hfa1p ist in den Mitochondrien lokalisiert, die restlichen Biotinproteine im Cytoplasma), wechselwirken könnte, ist wohl eher die Biotinylierung der verbleibenden Biotinproteine aufgrund eines Mangels von Biotinakzeptoren über eine längere Zeit gesichert.
Beispielsweise zeigt der arc1Δ-Stamm, der im Vergleich zum WT unter Normalbedingungen etwa eine doppelt so hohe Konzentration an freiem Biotin besitzt, zumindest im β−Galaktosidasetest, erst nach längerer Zeit in Niedrig-Biotinmedium eine normale Biotinmangelantwort (vgl. Abb.
3-25). Zudem ist es umgekehrt möglich, Reportergenaktivitäten durch die Überexpression der Biotindomäne von Pyc1p im arc1Δ-Stammhintergrund schon bei Normal-Biotinbedingungen zu stimulieren. Im WT-Stamm sieht man keinen Effekt, da Arc1p hier vielleicht als „Biotinpuffer“
dient (Daten nicht gezeigt).
Bei früheren Interpretationen galt es deshalb als unwahrscheinlich, dass Biotinproteine direkt an der Biotinwahrnehmung beteiligt sind [Pirner und Stolz, 2006]. In weiteren Experimenten konnte aber gezeigt werden, dass beim Fehlen beider Pyruvatcarboxylasegene auch nach längerer Inkubation unter Biotinmangel kein Biotinmangelsignal auslösbar ist (vgl. Abb. 3-25). Selbst durch das zusätzliche Entfernen des Biotintransportergens VHT1, was zu einem hohen internen Biotinmangel führt, kann der Hefestamm ohne die Pyruvatcarboxylasen die Expression eines biotinresponsiven Reportergens nicht steigern (vgl. Abb. 3-26). Dies deutet auf eine direkte Beteiligung der Pyc-Proteine an der Biotinwahrnehmung hin.
Eine weitere in Pirner und Stolz [2006] diskutierte Möglichkeit für die Beteiligung der Bpl1p an der Biotinmangelantwort ist die direkte Biotinylierung eines bislang unbekannten Biotinsensors, der in den Western Blots aufgrund einer zu geringen Proteinmenge jedoch nicht identifiziert werden konnte. Damit ein Biotinmangel von den Zellen wahrgenommen werden kann, bevor die Modifikation und damit die Aktivität der biotintragenden Enzyme abnimmt, müsste ein solcher Sensor eine geringe Affinität zu Bpl1p haben. Diese Eigenschaft trifft z.B. auf Arc1p, ein nicht-klassisches Biotinprotein, zu (vgl. Abb. 3-11 und [Kim H. S. et al., 2004]). Allerdings kann weder Arc1p der alleinige Sensor sein, da arc1Δ-Mutanten immer noch eine Biotinmangelantwort auslösen können (vgl. Abb. 3-23 und 3-25), noch ist bei diesem Modell die Funktion der Pyc-Proteine in der Biotinwahrnehmung berücksichtigt. Außerdem ist der Lysinrest, der in Arc1p modifiziert wird, selbst in nahe verwandten Hefen nicht konserviert [Kim H. S. et al., 2004] und nur wenige der von Jürgen Stolz und seinen Mitarbeitern untersuchten Hefespezies zeigen eine Arc1p-typische Bande (40 bis 50 kD) im mit Strep-PO dekorierten Western Blot (persönliche Mitteilung von Jürgen Stolz). Es ist allerdings bemerkenswert, dass Bpl1p auch Proteine mit einer nichtkanonischen Biotindomäne biotinylieren kann.
Wie vorher dargelegt, korreliert die Konzentration an intrazellulärem freien Biotin nicht mit dem Biotinmangelsignal. Obwohl bei den ELISA-Tests zur Bestimmung der internen freien Biotinkonzentration nicht zwischen Biotin und Biotinyl-AMP unterschieden werden konnte (vgl.
Kapitel 2.2.4.4), ist die Spekulation, dass Biotinyl-AMP ähnlich wie in Säugern das vorrangige Biotinsignal in S. cerevisiae-Zellen darstellen könnte [Pirner und Stolz, 2006], durch das nach den neuen Ergebnissen nötige Einbinden der Pyc-Proteine in der Biotinsignalkette nicht mehr wahrscheinlich. Wie auch in der Publikation von Pirner und Stolz [2006] schon erwähnt, fehlen in Hefe zudem Homologe der Guanylatzyklase und der cGMP-abhängigen Proteinkinasen.