Die Untersuchungen in Kapitel 4.3 belegen, dass die Pyruvatcarboxylasen eine direkte Aufgabe bei der Wahrnehmung von Biotin haben. Nach der Deletion beider Pyc-Gene ist in S. cerevisiae eine Biotinmangelantwort selbst bei starkem intrazellulären Biotinmangel nicht möglich (vgl. Abb.
3-26). Bei den β-Galaktosidasetests zeigte sich, dass wohl hauptsächlich Pyc2p Einfluss auf die Biotinmangelantwort besitzt. Bei pyc1-Mutanten ist die Biotinmangelantwort trotz Reduktion der Reportergenexpression sogar leicht erhöht (vgl. Abb. 3-24 und 3-29; Tab. 3-3, Seite 78). Eine Ausnahme bildet hierbei nur der Aufnahmetest mit radioaktiv markiertem Biotin (vgl. Tab. 3-2, Seite 77), bei dem im Falle von pyc1 die Biotinmangelantwort auch deutlich reduziert war. Dieser Effekt trat aber nur bei der Untersuchung von W303-1A basierten Stämmen auf und ist bei BY4741 basierten Stämmen nicht nachweisbar.
Die Pyruvatcarboxylasegene PYC1 und PYC2 sind eine Konsequenz der Genomduplikation („whole-genome duplication“), die in der Evolution von S. cerevisiae stattgefunden hat [Wolfe und Shields, 1997; Langkjaer et al., 2003] und zeigen mit einer Homologie von 92 % [Stucka et al., 1991] bzw. 93 % [Val et al., 1995] auf Aminosäureebene einen hohen Grad an Konservierung.
Größere Unterschiede sind jedoch vor allem in den C-terminalen Biotinbindedomänen mit einer Homologie von nur 62 % und besonders auch am C-Terminus zu finden [Stucka et al., 1991; Val et al., 1995].
Stucka et al. [1991] gibt mehrere Gründe an, warum Organismen duplizierte Gene bewahren. So gibt es Isoenzyme mit unterschiedlicher zellulärer Lokalisation [Kim K. S. et al., 1986; Rickey und Lewin, 1986], Isoenzyme, die sich in der Regulation der Expression unterscheiden [McAlister und Holland, 1982, 1985] und solche, bei denen eins der Enzyme neben der katalytischen auch eine regulatorische Rolle besitzt [Entian und Frohlich, 1984]. Zu den Eigenschaften von PYC1 und PYC2 findet man in der Literatur recht unterschiedliche Angaben. Nach Stucka et al. [1991], Menendez und Gancedo [1998] und Blazquez et al. [1995] können z.B. beide Gene das Wachstum in Glukose erhalten, während nach Brewster et al. [1994] pyc1-Mutanten den Zusatz von L-Aspartat für ein normales Wachstum in Minimalmedium brauchen. Auch finden die einen kaum einen Unterschied [Stucka et al., 1991], die anderen dagegen signifikante Unterschiede [Walker M. E. et al., 1991; Brewster et al., 1994] in den Aktivitäten der beiden Isoenzyme. Schließlich gibt es auch widersprüchliche Angaben, inwieweit die Expression der Pyc-Gene durch die Wachstumsphase oder die Kohlenstoffquelle beeinflusst wird [Brewster et al., 1994; Menendez und Gancedo, 1998]. Eine mögliche Ursache für die genannten Differenzen könnten der unterschiedliche genetische Hintergrund (W303-1A [Stucka et al., 1991; Blazquez et al., 1995;
Menendez und Gancedo, 1998] bzw. S288C und DBY746 [Brewster et al., 1994]) sowie die damit verbundenen polymorphen Formen von Pyc2p [Stucka et al., 1991; Val et al., 1995] sein. Es ist jedoch sicher, dass beide Pyc-Gene unterschiedlich und unabhängig reguliert werden und sie jeweils andere Promotorelemente aufweisen [Stucka et al., 1991; Brewster et al., 1994; Menendez und Gancedo, 1998]. Die Expression ist aber bei beiden Proteinen unabhängig von der Biotinkonzentration im Medium (vgl. Kapitel 3.1.2.1 und Abb. 3-27). Außerdem zeigen die Pyc-Proteine in den Western Blot-Analysen nach Anzucht in Niedrig-Biotinmedium scheinbar den geringsten Verlust an biotintragendem Enzym im Vergleich zu den anderen Biotinproteinen (vgl.
Abb. 3-11). Die Trennung von C-terminal markierten Pyc-Varianten im SDS-Gel machte aber deutlich, dass die Biotinbande von Pyc2p schwächer ist als die von Pyc1p und bei Biotinmangel nahezu ganz verschwindet (vgl. Abb. 3-27). Eine Veränderung der Effizienz der Biotinylierung durch die Markierung ist unwahrscheinlich, da der markierte C-Terminus zusammen mit dem N-terminalen Ende der biotintragenden Domäne in einem β-Faltblatt weit entfernt von dem Biotinyl-Lysinrest im exponierten β-Turn eines anderen Faltblattes liegt (vgl. 1.2.3.3 und [Polyak et al., 2001]).
Die Hypothese, dass Biotinmangel über eine Unterbiotinylierung von Pyc2p wahrgenommen wird, konnte im Laufe der Arbeit trotzdem nicht endgültig geklärt werden. Erstens kann man über den Biotinylierungsgrad (das Verhältnis von Apoprotein zu Holoprotein) anhand der Western Blots keine Aussage machen, da nur relative Expressionslevel zweier verschiedener Anzuchtbedingungen verglichen wurden und keine absoluten Proteinmengen bestimmt werden konnten. Zweitens führte die Substitution des biotintragenden Lysins zwar wie erwartet zu einem Verlust der Biotinylierbarkeit und der Aktivität von Pyc2p (vgl. Abb. 3-28), jedoch auch, genauso wie bei pyc2Δ, zu einem kompletten Verlust der Biotinwahrnehmung im pyc1-Hintergrund (vgl.
Abb. 3-29). Ein Anstieg der Reportergenexpression aufgrund des unbiotinylierten Apoproteins blieb aus. Es ist daher nicht eindeutig geklärt, ob die Unterbiotinylierung von Pyc2p doch kein Signal in der Biotinwahrnehmung darstellt, oder ob die Wechselwirkung von Pyc2p mit einem weiteren Protein durch die Mutation gestört ist. Eventuell ist in der Mutante die Struktur der Biotinylierungsdomäne verändert, obwohl der biotintragende Lysinrest an der Spitze eines β-Turns exponiert vorliegt und deswegen eine Mutation die Struktur des β-Barrels kaum stören sollte (vgl.
Kapitel 1.2.3.3).
Obwohl der Biotin-Protein-Ligase Bpl1p bislang eine indirekte Rolle bei der Biotinwahrnehmung zugesprochen wurde, könnte trotzdem auch eine fehlende Wechselwirkung der Pyc2p-Mutante mit Bpl1p zu dem Ausbleiben der Biotinmangelantwort führen. Nach Polyak et al. [2001] ist es möglich, dass die Anwesenheit eines korrekt positionierten Ziel-Lysinrestes, eingebettet in eine
strukturierte Biotinylierungsdomäne, für die Erkennung durch die Bpl1p erforderlich ist. Versuche mit E. coli BCCP-Mutanten, bei denen der biotintragende Lysinrest durch Leucin ausgetauscht wurde, zeigten schon, dass diese Mutanten die Biotinylierung der nativen Biotindomäne durch BirA nur schwach inhibierten und damit offensichtlich kaum mit BirA wechselwirken konnten [Chapman-Smith et al., 1999; Polyak et al., 2001]. Genauso wäre es im Falle von Pyc2p auch möglich, dass aufgrund des Lys/Arg-Austausches die Erkennung der unbiotinylierten Biotindomäne durch ein anderes Sensorprotein unterbunden wird. Schließlich könnte auch eine von der Biotinylierungsstelle unabhängige Region, welche jedoch für die Biotinmangelantwort wichtig ist, durch den Aminosäureaustausch beeinflusst sein und ihre Funktionalität verloren haben.
Um den Einfluss einer deutlich erhöhten Konzentration einer Biotindomäne auf die Biotinwahrnehmung in S. cerevisiae zu untersuchen, wurde die biotintragende Domäne von Pyc1p in den Zellen überexprimiert (Daten nicht gezeigt). Letztlich konnte hier aber nicht differenziert werden, ob die im β-Galaktosidasetest gemessenen erhöhten Reportergenaktivitäten primär aufgrund des vermehrten Auftretens von unbiotinylierter Pyc1p-Biotindomäne erzeugt wurden (der Biotinylierungsgrad von Pyc-Biotindomänen ist in einem gewissen Rahmen unabgängig vom Expressionslevel [Val et al., 1995]; bei verstärkter Expression steigt damit die Menge an biotinfreiem Protein) oder eher indirekt durch die allgemeine Erhöhung des Biotinbedarfs.
Diesbezüglich würde jedoch auch die Expression einer Pyc2p-Biotindomäne keinen Aufschluss bringen.
Bei den Untersuchungen zur Biotinylierung der Pyc-Proteine wurden genomisch markierte Versionen der Enzyme eingesetzt. Die C-terminale Markierung mit 3HA bzw. 9Myc scheint dabei weder die Biotinylierbarkeit noch die Funktionalität der Pyruvatcarboxylasen zu beeinträchtigen (vgl. Abb. 3-27 und 3-29). Auffällig ist jedoch, dass die Markierung der Proteine (wiederum hauptsächlich die von Pyc2p) die Biotinmangelantwort stört. So war in dem pyc1 PYC2-9Myc-Stamm die Reaktion der Zellen auf Biotinmangel gegenüber dem WT-PYC2-9Myc-Stamm und vor allem auch gegenüber dem pyc1-Stamm gehemmt (vgl. Abb. 3-29). Dasselbe galt auch für den PYC2-9Myc-Stamm und in geringem Maße für PYC1-3HA (Daten nicht gezeigt). Ein Test mit markiertem Pyc1p im pyc2-Hintergrund wäre nicht weiter aufschlussreich, da schon in pyc2-Mutanten die Biotinwahrnehmung fast nicht mehr möglich ist. Dies ist ein Hinweis, dass zumindest der C-terminale Bereich von Pyc2p eine wichtige Rolle in der Biotinmangelantwort spielt.
Bei Pyruvatcarboxylasen folgt nach der N-terminalen ATP-Binde- bzw.
Biotincarboxylierungsdomäne die Pyruvatbinde- bzw. Carboxyltransferasedomäne und schließlich
C-terminal die Biotinbindedomäne (vgl. die in Abb. 4-1 angegebenen Swiss-Prot-Einträge und [Lim et al., 1988]).
Interessanterweise besitzen die Pyruvatcarboxylasen aus Bäckerhefe nach der Biotinylierungsdomäne einen um meist 9 (Pyc1p) bzw. 10 Aminosäuren (Pyc2p) verlängerten C-Terminus gegenüber ihren homologen Proteinen und den meisten anderen Biotinproteinen aus verschiedenen Organismen. Der biotintragende Lysinrest ist damit statt der sonst üblichen 35 Aminosäuren 44 bzw. 45 Aminosäuren vom C-Terminus entfernt (vgl. Abb. 4-1; Kapitel 1.2.3.3;
Einträge bei Swiss-Prot bzw. SGD und [Morris et al., 1987; Val et al., 1995]). Eine Ausnahme bilden hierbei nur die Acetyl-CoA-Carboxylasen, bei denen die biotintragende Domäne zwischen der Biotincarboxylierungsdomäne und der Carboxyltransferasedomäne in der Polypeptidkette angeordnet ist (vgl. Abb. 4-1). Außerdem befindet sich bei Pyc2p in diesem C-terminalen Abschnitt ein Serinrest, welcher eventuell eine Phosphorylierungs- und damit auch eine Regulationsstelle darstellen könnte. Zusätzlich ist zu beachten, dass im Stammhintergrund von W303-1A, zu dem die hier verwendeten Pyruvatcarboxylasemutanten gehören, das Pyc2p-Protein sogar um zusätzliche 5 Aminosäuren verlängert ist [Stucka et al., 1991; Val et al., 1995].
Eine ähnliche Ausnahme bildet auch die Pyruvatcarboxylase aus Pichia pastoris mit einem 15 Aminosäuren langen Serin-enthaltenden C-terminalen Anhang [Menendez et al., 1998]. Es wäre somit aufschlussreich zu überprüfen, ob hier die Pyruvatcarboxylase ebenfalls eine essentielle Rolle in der Biotinwahrnehmung spielt und wie die Situation in S. pombe ist, deren Pyc-Protein nur eine Verlängerung um 2 Aminosäuren aufweist (Abb. 4-1).
Die Pyruvatcarboxylasen aller drei Stämme sind im Cytosol lokalisiert [Rohde et al., 1991; Walker M. E. et al., 1991], was einen weiteren Unterschied zu den mitochondriellen Pyruvatcarboxylasen aus Vertebraten darstellt.
Abb. 4-1: Sequenzvergleich von Biotindomänen verschiedener Proteine. Der Sequenzvergleich wurde mit Hilfe von CLUSTALW von PBIL durchgeführt (über ExPASy-Sequence alignment-PBIL: http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_clustalw.html) und ist analog dem Sequenzvergleich von Stolz et al. [1998]. Die Proteinsequenzen und die Ausdehnung der biotintragenden Domänen (Beginn der gezeigten Sequenz bis Begrenzungsstrich) wurden der Swiss-Prot-Datenbank entnommen. Der biotintragende Lysinrest wird durch ein schwarzes Dreieck angezeigt und die hoch konservierten Glycin- bzw. Methioninreste werden durch Sternchen markiert.
Im Folgenden werden die Abkürzungen und die jeweilige Swiss-Prot-Nummer aufgeführt. Sc_PYC1: [P11154], Pyruvatcarboxylase 1 aus S. cerevisiae; Sc_PYC2: [P32327], Pyruvatcarboxylase 2 aus S. cerevisiae; Pp_PYC:
[P78992], Pyruvatcarboxylase aus P. pastoris; Sp_PYC: [Q9UUE1], Pyruvatcarboxylase aus S. pombe; Mm_PYC:
[Q05920], Pyruvatcarboxylase aus Maus (M. musculus); Rn_PYC: [P52873], Pyruvatcarboxylase aus Ratte (R. norvegicus); Hs_PYC: [P11498], menschliche Pyruvatcarboxylase (H. sapiens); Bs_PYC: [Q9KWU4], Pyruvatcarboxylase aus B. subtilis; Kp_OAD: [P13187], α-Untereinheit der Oxalacetatdecarboxylase aus K. pneumoniae; Ps_TC: [P02904], 1.3S Untereinheit der Transcarboxylase aus P. shermanii; Sc_DUR1: [P32528], Harnstoffamidolyase aus S. cerevisiae; Ec_BCCP: [P0ABD8], Biotin-Carboxyl-Carrier-Protein der Acetyl-CoA-Carboxylase aus E. coli; Hs_PCCA: [P05165], α-Kette der menschlichen Propionyl-CoA-Acetyl-CoA-Carboxylase (H. sapiens);
Sc_ACC1: [Q00955], Acetyl-CoA-Carboxylase aus S. cerevisiae; Sc_HFA1: [P32874], mitochondrielle Form der Acetyl-CoA-Carboxylase aus S. cerevisiae.
Es ist allerdings nicht ganz auszuschließen, dass die beobachteten Effekte in der Biotinwahrnehmung durch die Markierung des Pyc2p-C-Terminus letztlich doch auf eine verringerte Biotinylierungseffizienz zurückgehen. Bei der Markierung von Pyc2p mit dem 9Myc-Epitop wurde nämlich für das Design der Primer die in SGD veröffentlichte Sequenz von PYC2
herangezogen (vgl. Kapitel 2.2.2.14), welche von der Sequenz im W303-1A-Stamm abweicht [Stucka et al., 1991]. Deshalb fehlen Pyc2p-9Myc die fünf letzten Aminosäuren des WT-Proteins.
Nach Val et al. [1995] weisen Peptide aus den kürzeren Biotindomänen von Pyc2p einen geringeren Biotinylierungsgrad durch die BPL aus E. coli auf. Andererseits führt die Markierung wieder zu einer künstlichen Verlängerung der Biotindomäne und es ist zudem nicht gewiss, ob sich die von den Autoren beobachteten Phänomene auf Volllängenproteine und die BPL aus S. cerevisiae übetragen lassen.
Um die Rolle des C-Terminus weiter zu analysieren, könnte man Verkürzungsprodukte der Pyruvatcarboxylasen bzw. auch nur die entsprechenden Biotindomänen [Val et al., 1995; Polyak et al., 2001] in Pyc-Doppeldeletionsmutanten exprimieren und die Biotinwahrnehmung prüfen.
Neben der enzymatischen Aktivität in der Synthese von Oxalacetat scheint eine Rolle in der Biotinmangelantwort allerdings nicht die einzige weitere Funktion der Pyruvatcarboxlyasen zu sein. So deuten Ergebnisse von Brewster et al. [1994] darauf hin, dass der Glyoxylatzuklus ohne ausreichende Pyc-Aktivität durch eine C2-Kohlenstoffquelle nicht stimuliert wird.
In methylotrophen Hefen wie Hansenula polymorpha und Pichia pastoris ist die cytosolische Pyruvatcarboxylase außerdem an der Aktivierung der Alkoholoxidase (AO), einem Schlüsselenzym des Methanolmetabolismus, beteiligt [Ozimek P. et al., 2003]. Hierbei spielt sie vermutlich eine Rolle bei der FAD-Bindung an AO-Monomere, was wiederum eine Voraussetzung für den Import der AO-Monomere in die Peroxisomen und die anschließende Oligomerisierung zu einer aktiven AO ist. Diese Aufgabe kann aber auch eine enzymatisch inaktive Pyruvatcarboxylase erfüllen [Ozimek P. et al., 2003]. In H. polymorpha wurde gezeigt, dass die Transcarboxylasedomäne von Pyc1p (dem einzigen Pyc-Protein in H. polymorpha) zusammen mit einer Region zwischen der Transcarboxylasedomäne und der Biotincarboxylasedomäne für die Funktion bei der AO-Oligomerisierung essentiell ist [Ozimek P.
Z. et al., 2007]. Obwohl die Pyruvatcarboxylasen aus S. cerevisiae eine Homologie von etwa 75 % zu Pyc1p aus H. polymorpha aufweisen, können sie diese jedoch bei der Aktivierung der AO nicht ersetzen [Ozimek P. et al., 2006].