Retrograde Apoptose-Induktion durch T2 Zellen

Abb. 43: (A) Korrelation zwischen dem Anteil Annexin-positiver Zellen und dem Zellschaden in Zielzellen. Melan-A- spezifische CTL wurden als Effektorzellen gegen Melan-A-beladene T2 Zellen (Zielzellen) eingesetzt. Nach 4 h Koinkubation wurden Ann⁺/PI^- sowie Ann⁺/PI⁺ und Ann^-/PI⁺ T2 Zielzellen ausgewertet. Werden in der Auswertung alle Ann⁺ Zellen erfasst (Ann⁺/PI^- und Ann⁺/PI⁺, offene Kreise), kann der meiste Zellschaden erfasst werden. (B) Die Ermittlung der Zytotoxizität von Melan-A-spezifischen CTL gegenüber Melan-A positiven (gefüllte Symbole) und Melan-A negativen (offene Symbole) Tumorzellen mittels 4 h ⁵¹Cr-Freisetzungstest im Vergleich mit der Apoptosedetektion im PKH26-Test ergibt vergleichbare Resultate. Der Hintergrundwert für apoptotische Zellen/ bzw.

51Cr-Freisetzung wurde jeweils herausgerechnet.

4.2.1.3 Retrograde Apoptose-Induktion durch T2 Zellen

Wie sich im ersten Teil der Arbeit zeigte, können DN T-Zellen sehr effektiv Apoptose in Antigen-spezifischen CTL induzieren. Es sollte nun ein Modellsystem zur Untersuchung Antigen-spezifischer Suppression etabliert werden. Dafür wurde die Zellinie T2 als Effektorzelllinie ausgewählt. Es sollte untersucht werden, ob von den Antigen-beladenen pMHC-Komplexen auf der T2 Zelle auch ein apoptotisches Signal für die

Antigen-spezifischen CTL ausgeht. Für diesen Versuch wurden CMV-spezifische und Melan-A-spezifische CTL als Zielzellen verwendet.

Es wurden zunächst zwei parallele PKH26-Tests durchgeführt, in denen T2 Zellen zum einen als Zielzellen, und zum anderen als Effektorzellen in Kokultur mit Antigen-spezifischen CTL eingesetzt wurden. Wie in Abb. 44 dargestellt, zeigte sich sowohl die bekannte "Vorwärts-Apoptoseindukion" (CTL lysiert die T2 Zelle, Abb. 44 A), wie auch eine "retrograde Apoptose-Induktion" (T2 Zelle lysiert die CTL, Abb. 44 B).

A.

CTL T2

TCR pMHC

B.

CTL T2

TCR pMHC

CTL T2

TCR pMHC

0 20 40 60 80 100

ohne 0,15 0,3 0,6 1,2 2,5 5 10 CTL : T2 Verhältnis

% PKH26+ apoptotische T2

0 20 40 60 80 100

ohne 0,15 0,3 0,6 1,2 2,5 5 10 T2 : CTL Verhältnis

% PKH26+ apoptotische CTL

Abb. 44: Vorwärtsapoptose und retrograde Apoptose zwischen Antigen-spezifischen CTL und Antigen-beladenen T2 Zellen. (A) T2 Zellen als Zielzellen: CMV spezifische CTL lysieren CMV-Peptid-beladene T2 Zellen (orange Quadrate).

(B) T2 Zellen als Effektorzellen: CMV-Peptid-beladene T2 Zellen induzieren Apoptose in CMV spezifischen CTL (retrograde Apoptose-Induktion, blaue Quadrate). Ermittlung der Apoptose im 4 h PKH26-Test mittels AnnexinV-Messung. Die T2 Zellen wurden mit 30 µg/ml CMV Peptid beladen. Ein zweites Experiment mit Melan-A- spezifischen CTL und Melan-A-beladenen T2 Zellen ist jeweils zusätzlich dargestellt (orange und blaue Dreiecke).

Das Phänomen der retrograden Apoptose-Induktion kann als Begleiterscheinung der Antigenerkennung der CTL angesehen werden. Um dieses Phänomen weiter abzuklären, wurde folgendes zusätzliche Experiment durchgeführt: Anstelle einer PKH26-Färbung der Zielzellen wurde eine MHC-Tetramer-PE-Färbung mit einer AnnexinV-Färbung kombiniert (Kanalbelegung im Durchflusszytometer wie in Tab. 1 dargestellt). Mit dieser Analyse kann das Schicksal der T-Zellen, die einen CMV-spezifischen TCR exprimieren, verfolgt werden. Wie in Abb. 45 sichtbar, sind es vor allem die TM⁺ Antigen-spezifischen CTL innerhalb der polyklonalen CTL-Linie, welche nach einem vierstündigen Kontakt mit Antigen-beladenen T2 Zellen apoptotisch werden. Im Gegensatz dazu bleibt die TM-

unspezifische CTL Population (Abb. 45, jeweils linke, untere Quadranten) auch bei höheren Effektor : Target Verhältnissen konstant AnnexinV negativ. Die apoptotische TM⁺ CTL Population wandert hingegen aus dem vitalen Quadranten (Abb. 45, jeweils linke, oberere Quadranten) ab in die AnnexinV-positiven rechtsgelegenen Quadranten.

Auch in diesem Experiment ist die Herunterregulation des TCR auf den spezifischen T-Zellen deutlich erkennbar: Die apoptotischen T-Zellen verlieren aufgrund des spezifischen Kontaktes mit CMV-MHC-I Komplexen auf der T2 Zelle ihren TCR auf der Zelloberfläche und erscheinen als TM^- Zellen, die vor allem im Annexin⁺ Quadranten (Abb. 45, untere, rechte Quadranten) zu finden sind.

Dieses Problem wurde bereits in Apoptose-Tests mit DN T-Zellen beobachtet und an früherer Stelle erläutert (vgl. Abb. 28 B rechte Spalte, S. 73).

AnnexinV FITC

ohne Abb. 45: Apoptose-Induktion in

spezifischen CTL nach Inkububation mit CMV-Peptid-beladenen T2 Effektorzellen.

CMV-Peptid-beladene T2 Zellen wurden in den Verhältnissen 0,1 : 1; 0,3 : 1 und 0,6 : 1 als Effektorzellen verwendet. Zielzellen sind CMV-spezifische CTL. Für dieses Experiment kamen dieselben Zellen wie in Abb. 44 zum Einsatz.

Mittels einer CMV-MHC-Tetramer (TM)-PE Färbung (y-Achse) nach dem 4 h Apoptose-Test kann die Apoptose-Induktion in den Antigen-spezifischen CTL nach dem Kontakt mit T2 Effektorzellen verfolgt werden. Der prozentuale Anteil der Zellen in den einzelnen Quadranten an der Gesamtzellzahl ist in den Dotplots angegeben. Auf der x-Achse sind die apoptotischen Zellen, ermittelt anhand der AnnexinV Färbung, dargestellt. Die Kanal-belegung im Durchflusszytometer entspricht Tab. 1.

Im nächsten Schritt sollte geklärt werden, ob pMHC-I Komplexe die Schlüsselmoleküle bei der retrograden Apoptose-Induktion darstellen bzw. ob die Apoptose-Induktion Antigen-spezifisch ist. Hierzu wurden T2 Zellen, die mit einem irrelevanten Peptid (gp100) beladen wurden bzw. unbeladene T2 Zellen in den Apoptosetest eingesetzt (Abb.

46). Die Apoptose-Induktion in den Antigen-spezifischen CTL wurde wiederum im PKH26-Test ausgelesen. Dabei zeigte sich klar, dass nur T2 Zellen, welche mit dem adäquaten Peptid beladen sind, zur Apoptose-Induktion von CTL befähigt sind. Obwohl die Beladung der T2 Zellen mit Melan-A sogar mit weniger Peptid (3 ng/ml) durchgeführt wurde als die Beladung mit gp100-Beladung (30µg/ml), geht aus dem Versuch deutlich die Antigenspezifität der retrograden Apoptose-Induktion hervor.

0 Peptid-beladene T2 Zellen. T2 Zellen wurden mit unterschiedlichen Peptiden beladen und auf ihre Fähigkeit, Apoptose in Melan-A- spezifischen CTL zu induzieren, getestet.

Eingesetzte Peptidkonzentration für die Beladung der T2 Zellen: 30 µg/ml gp100, 3 ng/ml Melan-A. 4 h Koinkubation von Effektor- und Zielzellen im PKH26-Test.

Eine Titration der Peptidbeladung von T2 Zellen sollte zeigen, dass die Apoptose-Induktion in CTL mit der gebundenen Peptidmenge korreliert. Hierfür wurde ein retrograder PKH26 Apoptose-Test durchgeführt, in dem T2 Zellen, welche mit unterschiedlichen Konzentrationen von Melan-A-Peptid beladen worden waren, als Effektorzellen verwendet wurden. Melan-A-spezifische CTL dienten als Zielzellen. Wie in Abb. 47 dargestellt ist, lässt sich die Apoptose-induzierende Wirkung der Peptid-beladenen T2 Zellen durch eine Titration des Peptides vermindern. Da sich die T2 Zellen aufgrund ihrer TAP-Defizienz sehr effektiv exogen mit Peptiden beladen lassen, bedarf es einer 10⁴ - bis 10⁵- fachen Verdünnung des Peptids, um diesen Effekt zu vermindern (Abb. 47). in Antigen-spezifischen CTL durch Titration der Peptidkonzentration auf den T2 Zellen. T2 Zellen wurden mit Melan-A Peptid in einer Konzentration von 0,3 ng/ml bis 30 µg/ml beladen und gegen PKH26⁺ Melan-A-spezifische CTL eingesetzt. Dargestellt ist der prozentuale Anteil AnnexinV⁺ CTL innerhalb der gesamten CTL nach Koinkubation mit Peptid-beladenen T2 Zellen in T2 : CTL Verhältnissen von 0,1 : 1 bis 10 : 1.

4.2.1.4 Mechanismen der retrograden Apoptose-Induktion durch T2 Zellen