Mechanismus der Antigen-spezifischen Suppression

Um der Frage nachzugehen, über welchen Mechanismus DN T-Zellen die Apoptose-Induktion in Antigen-spezifischen CD8⁺ CTL vermitteln, wurden Blockierungsversuche durchgeführt. Hierbei kam zunächst Concanamycin-A (CMA), ein sehr effektiver

Inhibitor der Perforin/ Granzyme-vermittelten Apoptose, zum Einsatz. Die CMA-Behandlung der CTL wurde für 20 h vor dem Test durchgeführt, damit das intrazellulär vorhandene Perforin abgebaut wird. Um die Hochregulation des Perforin-Gehaltes während des Apoptose-Tests zu verhindern, wurde CMA auch während des Tests in der gleichen Konzentration zugegeben.

In einer Positivkontrolle konnte verifiziert werden, dass CMA die Zytolyse von zytotoxischen T-Zellen inhibiert. Hierfür wurden Melan-A-spezifische CTL als Effektorzellen im PKH26-Test gegen Melan-A-beladene, PKH26⁺ T2 Zielzellen eingesetzt.

Dabei verzeichnet man eine deutliche Abnahme der Apoptose-Induktion in den Zielzellen bei Verwendung von CMA (Abb. 34 B). Im Gegensatz dazu konnte die Apoptose-Induktion durch DN T-Zellen nicht mit CMA blockiert werden (Abb. 34 A). Diese Resultate beweisen, dass die DN T-Zell-vermittelte Apoptose nicht über den vesikulären Granzyme/Perforin-Signalweg vermittelt wird.

A.

% Annexin+ Zielzellen ohne CMA mit CMA

Abb. 34: Blockierungsversuche zur Antigen-spezifischen Apoptose-Induktion in CTL durch DN T-Zellen mit Hilfe von CMA. (A) Einsatz von CMA im Apoptose-Test mit dem TCRαβ⁺ DN T-Zell-Klon 1D6. Effektorzellen:

Klon 1D6, der mit Melan-A-beladenen DC konditioniert wurde. Zielzellen: Melan-A-spezifische CTL. Schwarze Kreise: ohne CMA; rote Kreise: mit CMA. (B). Positivkontrolle: PKH26-Test, in welchem Melan-A-spezifische CTL mit zunehmendem Effektor : Target Verhältnis Melan-A-beladene T2 Zielzellen lysieren. Die Zielzell-Lyse durch Melan-A-spezifische CTL-Effektorzellen ist durch CMA gut blockierbar.

Weiter wurden Intrazellulärfärbungen von DN T-Zellen mit einem anti-Perforin- und anti-Granzyme-B-Antikörper durchgeführt. Hierfür wurden TCRγδ⁺ DN T-Zellen aus einem buffy coat angereichert. Nach einer 24-stündigen Kokultur mit reifen, allogenen DC wurden die DN T-Zellen für die Analyse verwendet. Nach einer 24-stündigen Kokultur mit reifen DC exprimieren TCRγδ⁺ DN T-Zellen zwar Perforin, sind jedoch negativ für Granzyme-B (Abb. 35 A). Antigen-spezifische CTL hingegen produzieren intrazellulär große Mengen von Perforin und Granzyme-B (Abb. 35 B). Während Perforin konstitutiv auch in naiven T-Zellen produziert werden kann, ist hauptsächlich intrazelluläres Granzyme-B entscheidend für die Lysekapazität von zytotoxischen T-Zellen. Demnach

scheinen TCRγδ⁺ DN T-Zellen, da Granzyme-B fehlt, nicht zur typischen Zielzelllyse durch das Zusammenwirken von Perforin/Granzyme in der Lage zu sein. Eine phänotypische Untersuchung von TCRαβ⁺ DN T-Zellen bezüglich Granzyme-B und Perforin wurde noch nicht durchgeführt.

A.

B.

Gzm-B

Perf Perf

Gzm B Perf

naive CD8+

Lymphozyten

Antigen-spezifische CTL

Fluoreszenzintensität PE

Gzm B Perf

naive CD8+

Lymphozyten

Antigen-spezifische CTL

Gzm B Perf

naive CD8+

Lymphozyten

Antigen-spezifische CTL

Fluoreszenzintensität PE

Abb. 35: Intrazellulärfärbungen mit anti-GranzymeB-PE (Gzm) und anti-Perforin-PE (Perf) monoklonalen Antikörpern. (A) Fluoreszenzsortierte TCRγδ⁺ DN T-Zellen nach 24-stündiger Kokultur mit allogenen, reifen DC. (A) Naive T-Lymphozyten bzw. Antigen-spezifische CTL nach dreiwöchiger Stimulation mit autologen, Antigen-beladenen, reifen DC. Rote Histogramme: Isotypkontrolle; Violette, gefüllte Histogramme: Antikörperbindung.

4.1.6.5.2 Der Fas/FasL Signalweg

Wie in der Einleitung ausgeführt, ist das Rezeptorpaar Fas/FasL in eine Reihe apoptotischer Prozesse involviert, und wird allgemein als Hauptsignalweg des AICD angesehen. Um zu untersuchen, ob der Fas/FasL Signalweg eine Rolle spielt bei der Apoptose-Induktion in Antigen-spezifischen CTL durch DN T-Zellen, wurde das Oberflächenmolekül Fas im Apoptose-Test blockiert. CD8⁺ CTL wurden, bevor sie als Zielzellen im Apoptose-Test eingesetzt wurden, mit 10 µg/ml eines blockierenden monoklonalen anti-Fas-Antikörpers (Klon ZH-4) inkubiert. Durch die Bindung des Antikörpers an die CTL soll die mögliche Apoptose-Induktion durch FasLigand im Apoptose-Test inhibiert werden.

0 in Antigen-spezifischen CTL durch DN T-Zellen. Analyse der Apoptose-Inhibition durch den Einsatz des neutralisierenden, monoklonalen anti-Fas-Antikörpers (Klon ZH-4) in einem Apoptose-Test mit dem konditionierten TCRαβ⁺ DN T-Zell-Klon 1D6. Dargestellt ist der Anteil vitaler, spezifischer CTL innerhalb der CD8⁺ CTL (Zielzellen) nach Kokultur mit einer ansteigenden Menge von konditionierten TCRαβ⁺ DN T-Zellen (Effektorzellen).

Schwarze Kreise: Unblockierte CD8⁺ CTL;

gefüllte blaue Kästchen: CTL wurden für 30 min mit anti-Fas-Antikörper blockiert.

Wie in Abb. 36 dargestellt, kommt es durch die Blockierung der DN T-Zellen mit einem neutralisierenden, monoklonalen anti-Fas Antikörper zu keiner Inhibition der Apoptose von Antigen-spezifischen CTL. Dieses Resultat deutet darauf hin, dass die Wechselwirkung zwischen Fas und FasL keine bedeutende Rolle für die Apoptose-Induktion durch DN T-Zellen spielt.

Es wurde auch versucht, oberflächenständige FasLigand-Moleküle auf den DN T-Zellen nachzuweisen. Um eine mögliche niedrige Expression von FasLigand-Molekülen zu verstärken, wurde ein enzymatisches Verstärkungssystem für die Antikörperfärbung eingesetzt. Dabei wurden sowohl sorierte TCRγδ⁺ DN T-Zellen als auch der TCRαβ⁺ DN T-Zell-Klon 1D6 untersucht. Die DN T-Zellen wurden nach 24-stündiger Koinkubation mit autologen, reifen dendritischen Zellen für die Analyse verwendet. Es konnte keine Expression von FasL auf der Oberfläche von DN T-Zellen nachgewiesen werden (Abb. 37).

FasL-FITC EAS verstärkt TCRαβ+ αβ+ αβ+ αβ+

Klon 1D6 TCRγδ+γδ+γδ+γδ+DN T-Zellen isoliert

FasL-FITC EAS verstärkt FasL-FITC EAS verstärkt

TCRαβ+ αβ+ αβ+ αβ+

Klon 1D6 TCRγδ+γδ+γδ+γδ+DN T-Zellen isoliert

Abb. 37: Fehlende Expression von FasLigand auf der Zelloberfläche des TCRαβ⁺DN T-Zell-Klons 1D6 (linkes Histogramm) und auf der Zelloberfläche von sortierten TCRγδ⁺DN T-Zellen (rechte Histogramme).

Die 1D6 Zellen wurden der Klon-Expansionskultur entnommen, die TCRγδ⁺ DN T-Zellen wurden durch Fluoreszenzsortierung aufgereinigt. Blaue Histo-gramme: Isotypenkontrolle; Rote HistoHisto-gramme: anti-FasL- Antikörper (Klon NOK-1). Das Fluoreszenzsignal wurde enzymatisch verstärkt.

4.1.7 Die Rolle von DN T-Zellen bei Patienten mit