verschiedenen Signalwegen Apoptose
2.3. Regulationen von Mitgliedern der Bcl-2 Familie wurden vorerst in der ActA-induzierten Apoptose ausgeschlossen
In dem TGF-β1 Apoptosemodell Oli-neu konnte eine Verminderung der Expression des anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedes Bcl-xl gezeigt werden85,87. Die Abnahme von Bcl-xl erfolgte sowohl auf dem Level der RNA als auch auf Proteinebene. Dabei konnte die Herunterregulation des Bcl-xl Proteins nicht nur auf dem Level der Expression, sondern auch durch die Degradation der basalen Bcl-xl Proteinmengen ermittelt werden (diese Arbeit). Die Verminderung der Bcl-xl mRNA und ihrer Expression kann dabei unabhängig von der Bcl-xl Proteindegradation laufen (Ergebnisse, Abschnitt 1).
2.3.1. Die Bcl-xl Proteinexpression wird nicht durch ActivinA reguliert
Es wurde zunächst geprüft, ob das Bcl-xl Protein auch in den ActA-induzierten Apoptosemechanismen reguliert wird. Für Western Blot Experimente mit dem Bcl-xl Antikörper wurden Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten mit 5ng/ml TGF-β1 oder 50ng/ml ActA behandelt und der Gesamt-Proteinextrakt isoliert. Als Ladekontrolle wurde Gapdh verwendet. In der Abbildung 30A ist dargestellt, dass eine ActA Behandlung nicht zur Reduktion des basalen Bcl-xl Proteins führte. Die Bandenintensitäten blieben zu allen Zeitpunkten unverändert hoch. Im Vergleich dazu erfolgte die TGF-β1-induzierte Herunterregulation des Bcl-xl Proteins.
Da die transkriptionelle Regulation der Expression unabhängig von der Bcl-xl Proteindegradation verlaufen kann, wurde die Bcl-xl mRNA Expression in ActA-behandelten Proben überprüft. Dazu wurden Oli-neu Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit ActA behandelt und die Gesamt-RNA isoliert. Die verwendeten Primer für die anschließende RT-PCR sind in Tabelle 1 (Material und Methoden) aufgeführt. Die individuelle Zyklenzahl und Anlagerungstemperatur für das Bcl-xl Primerpaar ist in Tabelle 6 (Material und Methoden) aufgelistet. In Abbildung 30B ist die semi-quantitative Bcl-xl RT-PCR gezeigt. Zu keinem Zeitpunkt wurde eine Abnahme des Bcl-xl Transkripts ermittelt.
IV. Ergebnisse 101
Eine weitere Analyse der Bcl-xl mRNA Expression wurde mittels Luciferaseexperimenten durchgeführt, da der Ausschluss einer Herunteregulation der Bcl-xl Expression bekräftigt werden sollte. Für die Bestimmung der Bcl-xl Promotoraktivität wurden Zellen mit dem Luciferase-Reporterplasmid pGL3-Bcl-xl und mit dem pCMV-β-Gal Plasmid für die Kontrolle der Transfektionseffizienz transfiziert. Nach einer 2 stündigen Inkubation mit den Konstrukten wurden die Zellen für 14 Stunden mit 50ng/ml ActA behandelt. Nach der Zelllyse erfolgte die Messung der Luciferaseaktivität und der β-Galaktosidaseexpression (Material und Methoden, Abschnitt 2.3.3.). Die relative mRNA Expression bzw. Bcl-xl Promotoraktivität in RLU (Luciferaseaktivität/Galaktosidaseexpression) ist in Abbildung 30D dargestellt. In den Bcl-xl Promotorexperimenten konnte ebenfalls keine verminderte Bcl-xl Expression in Bezug auf eine ActA Behandlung bestimmt werden.
2.3.2. Expressionsanalyse weiterer Mitglieder der Bcl-2 Familie
In Bezug auf eine mögliche ActA-induzierte Regulation anderer Bcl-2 Familienmitglieder wurde das Hauptaugenmerk auf Proteine der anti-apoptotischen „Bcl-2 Subfamilie“ und pro-apoptotischen „Bax Subfamilie“ gelegt, da diese beiden Subfamilien maßgeblich an mitochondrialen Veränderung beteiligt sind41. Mit Hilfe einer Expressionsanalyse sollten erste Hinweise oder Ausschlüsse getroffen werden.
Daher wurden Oli-neu Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit ActA behandelt. Nach der Isolierung der Gesamt-RNA und dem Umschreiben der mRNA in cDNA wurden für die Gene Bcl-2, Bak und Bax Expressionsanalysen mittels RT-PCRs durchgeführt. Die verwendeten Primer für die semi-quantitativen RT-PCRs und die individuelle Zyklenzahlen und Anlagerungstemperaturen der Primerpaare sind in Tabelle 1 und Tabelle 6 (Material und Methoden) aufgelistet. Zu keinem Zeitpunkt wurde eine transkriptionelle Regulation der Expressionen von Bcl-2, Bak oder Bax ermittelt (Abbildung 30B ).
Die densitometrischen Auswertungen der semi-quantitativen RT-PCRs von Bcl-xl, Bcl-2, Bak und Bax sind in Abbildung 30C graphisch wiedergegeben. Dabei beziehen sich die Messungen nur auf eine repräsentative RT-PCR von insgesamt zwei unabhängig durchgeführten Versuchen mit jeweils zwei durchgeführten semi-quantitativen RT-PCRs.
Zur weiteren Analyse der Bcl-2 mRNA Expression wurden Luciferaseexperimente herangezogen. Für die Bestimmung der Bcl-2 Promotoraktivität wurde das Reporterplasmid pGL3-Bcl-2 und das pCMV-β-Gal Plasmid als Kontrolle der Transfektionseffizienz in die Oli-neu Zellen eingebracht. Nach einer 2 stündigen Inkubation mit den Konstrukten erfolgte eine 14 stündige ActA (50ng/ml) Behandlung. Nach der Zelllyse wurden die Luciferaseaktivität und die β-Galaktosidaseexpression (Material und Methoden, Abschnitt
IV. Ergebnisse 102
2.3.3.) gemessen. Die relative mRNA Expression bzw. Bcl-2 Promotoraktivität in RLU (Luciferaseaktivität/Galaktosidaseexpression) ist in Abbildung 30E zu sehen. Die Bcl-2-Promotorexperimente zeigten keine verminderte Bcl-2 Expression in Bezug auf eine ActA Behandlung.
Da die Expressionsanalyse in ActA-behandelten Proben den Ausschluss von Hauptregulatoren der Bcl-2 Familie wie Bcl-xl, Bcl-2, Bak und Bax aufzeigte, wurden mögliche ActA-induzierte Regulationen der Bcl-2 Familie vorerst nicht mehr in Erwägung gezogen und vorläufig nicht mehr weiter untersucht. Letztendlich stellte diese Erkenntnis einen Unterschied zur TGF-β1-induzierten Apoptose dar, in der eine Herunterregulation der Bcl-xl Proteinmengen erfolgte.
IV. Ergebnisse 103
Abbildung 30: Untersuchungen an Mitgliedern der Bcl-2 Familie.
(A) Western Blot Experimente mit ActA-behandelten Oli-neu Zellen. Die Zellen wurden zu unterschiedlichen Zeiten mit 50ng/ml ActA behandelt und der Gesamt-Proteinextrakt für die Analyse der basalen Bcl-xl Proteinmengen im Western Blot eingesetzt. TGF-β1-behandelte Proben dienten als Positivkontrolle. Gapdh wurde zur Kontrolle der äquivalent eingesetzten Proteinmengen detektiert. Im Vergleich zu der TGF-β1-induzierten Reduzierung des Bcl-xl Proteins, wurde für ActA keine Abnahme der basalen Bcl-xl Proteinmengen ermittelt.
IV. Ergebnisse 104
(B) Semi-quantitative RT-PCRs für Bcl-xl, Bcl-2, Bak und Bax von ActA-behandelten Proben. Die mRNAs von zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit ActA-behandelten (50ng/ml) und unbehandelten Oli-neu Zellen wurden isoliert und äquivalente Mengen für eine RT-Reaktion eingesetzt. Mit den in der Tabelle 1 angegebenen Primerpaaren wurden semi-quantitative PCR für Bcl-xl, Bcl-2, Bak und Bax durchgeführt. Gapdh diente als interner Standard. Die Anlagerungstemperaturen der jeweiligen Primer und unterschiedlichen Zyklenanzahlen der PCR-Amplifikationen sind in der Tabelle 6 (Material und Methoden) zusammen gefasst. In ActA-behandelten Proben wurde für keines der untersuchten Bcl-2 Familienmitglieder eine Änderung der mRNA Expression gezeigt.
(C) Quantitative Bestimmung der semi-quantitativen RT-PCRs von Bcl-xl, Bcl-2, Bak und Bax in ActA-behandelten Proben. Die graphische Darstellung gibt die densitometrischen Auswertungen der analysierten Bcl-2 Genexpressionen an. Dabei bezieht sich die Auswertung auf die Messung von einer von zwei durchgeführten semi-quantitativen PCR-Reaktionen aus zwei unabhängigen Experimenten.
(D), (E) Bestimmung der mRNA Expression bzw. Promotoraktivität von Bcl-xl und Bcl-2 mittels Luciferaseexperimenten. Oli-neu Zellen wurden mit dem pGL3-Bcl-xl bzw. pGL3-Bcl-2 Luciferase-Reporterplasmid und dem pCMV-β-Gal Plasmid als Kontrolle der Transfektionseffizienz transfiziert. Nach einer Inkubationsphase von 2 Stunden wurden die Proben für 14 Stunden mit ActA (50ng/ml) behandelt. Der Gesamt-Proteinextrakt wurde für Luciferasemessungen weiter verwendet. Die relative mRNA Expression bzw.
Promotoraktivität in RLU (Luciferaseaktivität/Galaktosidaseexpression) zeigten keine Veränderung der Bcl-xl oder Bcl-2 Expression nach einer ActA Behandlung an.
Die angegebenen Standardabweichungen stehen für ±SEM von jeweils zwei unabhängigen Experimenten mit Doppelmessungen.