Der Apoptose-induzierende Faktor (AIF) ist in der ActA-induzierten Apoptose involviert

Während AIF eine lebenswichtige Rolle in der Atmungskette spielt, erscheint der Faktor durch Translokalisierung in den Zellkern als ein apoptotisches Protein. Der Freisetzung von AIF aus dem Mitochondrium in den Kern folgt eine DNA-Fragmentierung durch AIF und verschiedenen Ko-Faktoren⁵⁸. Die AIF-Aktivierung verläuft dabei unabhängig von Effektorcaspasen.

Da in den Oli-neu Zellen die Effektorcaspasen-9 und -3 gar nicht bzw. sehr gering in den ActA Signalwegen aktiv waren, wurde nach Faktoren gesucht, die unabhängig von Effektorcaspasen eine DNA-Fragmentierung einleiten können. Das Hauptaugenmerk wurde daher auf AIF gelegt, da dieser apoptotische Faktor fast ausschließlich an Caspase-unabhängigen Signalwegen beteiligt ist⁹⁵.

2.6.1. AIF wandert ActA-vermittelt in den Zellkern

Für die Überprüfung der AIF Translokalisierung in den Zellkern bzw. der AIF Aktivierung wurden ActA-behandelte Proteinproben nach ihren Zellkompartimenten getrennt. Zum Vergleich zur TGF-β1-vermittelten Apoptose wurden TGF-β1-behandelte Proben mitgeführt.

Dabei wurden verschiedene Zeitpunkte (16 Stunden und 24 Stunden) für die Behandlung mit den Zytokinen gewählt. Die mitochondrialen, zytosolischen und nukleären Proteinphasen wurden über einen Western Blot mit einem Antikörper gegen AIF untersucht, da das mitochondriale Protein im aktiven, apoptotischen Zustand über das Zytosol in den Kern translokalisiert. Zur Überprüfung der Ladung und Reinheit der verschiedenen Phasen wurde für die mitochondriale Phase ein CoxIV Antikörper, für die zytosolische Phase der Gapdh Antikörper und für die Kernphase der H1 Antikörper gewählt. In den TGF-β1-behandelten

IV. Ergebnisse 111

Proben wurde keine vermehrte AIF Translokalisierung in den Zellkern detektiert. Jedoch wurden geringe AIF Proteinmengen in unbehandelten Proben in der Kernphase gezeigt (Abbildung 34B). Dieses Grundlevel an AIF Protein geht mit der Grundapoptose der Oli-neu Zellen in Kulturbedingungen einher. Im Gegensatz dazu erschien eine 2,5facheVerstärkung der AIF Translokalisierung in den Kern in ActA-behandelten Proben (Abbildung 34A). Eine AIF Zunahme im Zytosol wurde weder für ActA noch für TGF-β1 detektiert, wobei die späten Zeitpunkte eine Erklärung dafür sind.

Für die Bestätigung der AIF Translokalisierung in den Kern unter ActA Bedingungen wurden immunzytochemische Translokalisierungsexperimente durchgeführt. Dazu wurden ActA-behandelte Zellen (50ng/ml für 16 Stunden) mit einem Antikörper gegen das AIF Protein immunzytochemisch behandelt und der AIF-Antikörper mit einem Cy3-konjugierten Sekundärantikörper nachgewiesen. Der Zellkern wurde mit DAPI angefärbt. Die Analyse erfolgte mit einem Fluoreszenzmikroskop. Im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen wurde eine deutliche Kern-Lokalisierung von AIF in ActA-behandelten Proben gezeigt.

Während in den Kontrollzellen das AIF Protein zytosolisch und granulär detektiert wurde, erschien AIF in ActA-behandelten Proben vermehrt im Zellkern (Abbildung 34C). Zudem wiesen Zellkerne, in denen AIF nach einer ActA Behandlung detektiert wurde, eine kondensierte und fragmentierte Morphologie auf.

Somit stellt die ActA-vermittelte Translokalisierung von AIF in den Kern einen prägnanten Unterschied zum TGF-β1-induzierten Signalweg dar. Gleichzeitig wurde erstmals eine Involvierung von AIF in apoptotischen ActA-vermittelten Signalwegen gezeigt^12,58,95.

IV. Ergebnisse 112

Abbildung 34: ActA-induzierte AIF Translokalisierung vom Mitochondrium in den Zellkern.

(A), (B) Überprüfung der Translokalisierung von AIF in den Kern durch Proteinfraktionierung und anschließender Western Blot Analyse. Oli-neu Zellen wurden für 16 und 24 Stunden mit 50ng/ml ActA oder 5ng/ml TGF-β1 behandelt und die Proteine nach ihren Zellkompartimenten aufgetrennt. Die zytosolische, mitochondriale und die nukleäre Phase wurden mit einen Western Blot auf eine mögliche Translokalisierung von

IV. Ergebnisse 113

AIF vom Mitochondrium, über das Zytosol in den Kern untersucht. Als Ladekontrolle und zur Überprüfung der Reinheit der einzelnen Phasen wurde für das Zytosol Gapdh, für die mitochondriale Fraktion CoxIV und für die Kernphase das H1 Protein gewählt. Im Gegensatz zu TGF-β1-behandelten Proben führte eine ActA Behandlung zur Translokalisierung von AIF in den Kern und somit zu einer Aktivierung des apoptotischen AIF Proteins.

(C) Immunzytochemische Analyse der AIF Translokalisierung in den Zellkern. Nach einer Zugabe von 50ng/ml ActA für 16 Stunden wurden die Oli-neu Zellen für immunzytochemische Untersuchungen mit dem AIF Antikörper weiterbehandelt. Der Zellkern wurde mit einer DAPI-Färbung sichtbar gemacht und die Proben fluorometrisch analysiert. Nach der Behandlung der Zellen mit ActA wurde eine deutliche Zunahme von AIF im Zellkern ermittelt. Im Vergleich zu der ActA-vermittelten AIF-Kernfärbung erschien das AIF Protein in unbehandelten Proben granulär und zytosolisch.

2.6.2. Eine Hemmung der AIF Funktion verringert die ActA-induzierte Apoptose

Da die Involvierung von AIF in der ActA-vermittelten Apoptose eindeutig gezeigt wurde, sollte weitergehend analysiert werden, ob eine Verringerung der AIF Proteinmengen bzw.

eine Blockierung der AIF Funktion auf die ActA-induzierte DNA Fragmentierung einwirken kann.

Für die Hemmung der AIF Funktion wurden verschiedene GFP-gekoppelte siRNA antisense-Sequenzen gegen das AIF Transkript (siAIF1, siAIF2 und siAIF3) gewählt.

Um die Reduktion der basalen AIF Proteinmengen durch die GFP-gekoppelten siRNAs (siAIF1 bis siAIF3) zu überprüfen, wurden Oli-neu Zellen mit den verschiedenen siRNAs gegen AIF transfiziert. Nach einer 2 tägigen Inkubationsphase der siAIFs wurden die Zellen trypsiniert und für eine Zellsortierung vorbereitet. Das Sortieren der transfizierten Zellen war notwendig, da Oli-neu Zellen nur eine geringe Transfektionseffizienz von 10% aufweisen und diese Effizienz nicht ausreicht, um eine reale Reduktion des AIF Proteins in einzelnen, transfizierten Zellen zu ermitteln. Nach der Zellsortierung von GFP-transfizierten Zellen wurden die Proben lysiert und mit dem Gesamt-Proteinextrakt ein Western Blot gegen das AIF Protein durchgeführt. In Abbildung 35A ist dargestellt, das die siRNA gegen das AIF1 Transkript mit einer 0,31 fachen Reduktion des AIF Proteins am besten zu funktionieren schien. Im Vergleich dazu wird in der AIF knock-down Harlequin-Maus das AIF Protein auf das maximal 0,2fache gesenkt⁵⁸. Ein vollständiges Blockieren des AIF Proteins würde in den Zellen zur Lethalität führen⁵⁸.

Um die Auswirkungen des AIF knock-downs in ActA-behandelten Oli-neu Zellen zu untersuchen, wurden Zellen mit der siAIF1 oder einer non-sense siRNA als Kontrollprobe für 2 Tage transfiziert. Nach einer 20 stündigen Behandlung mit ActA oder TGF-β1 wurden die Zellen fixiert. Nach der Fixierung erfolgte eine TUNEL Färbung zur Ermittlung fragmentierter und somit apoptotischer Zellen. Für die Auswertungen wurden GFP positive

IV. Ergebnisse 114

Zellen gezählt (Abbildung 35C). In Abbildung 35B ist die Zählung graphisch dargestellt und zeigt, dass ein AIF knock-down die ActA-vermittelte Apoptose reduzierte. Im Vergleich dazu hatte der AIF knock-down keine Auswirkungen auf die TGF-β-vermittelte Apoptose. Mit diesen Ergebnissen wurde die Involvierung von AIF in der ActA-induzierten Apoptose bestätigt und gleichzeitig die AIF-Abhängigkeit des apoptotischen ActivinA Signalweges gezeigt.

Abbildung 35: Die AIF-Abhängigkeit in der ActA-vermittelten Apoptose.

(A) Überprüfung der Funktionalität verschiedener siRNA Transkripte gegen AIF. Verschiedene GFP-gekoppelten siRNA antisense-Sequenzen gegen das AIF Transkript (siAIF1, siAIF2 und siAIF3) wurden in

Oli-IV. Ergebnisse 115

neu Zellen transfiziert und für 48 Stunden inkubiert. Nach der Sortierung von GFP-positiven Zellen wurden diese lysiert und Gesamt-Proteinextrakt für einen WB mit einem AIF-Antikörper gewonnen. Gapdh diente als Ladekontrolle.

(B) Graphische Darstellung der immunzytochemischen Analyse apoptotischer Zellen mit anschließender Zählung (C). Mit **P<0.01 ist die statistische Signifikanz angegeben, die über den Student´s t-test ermittelt wurde. Die angegebenen Standardabweichungen stehen für ±SEM jeweils zwei unabhängigen Experimenten mit Doppelbestimmungen.

(C) Immunzytochemische Analyse apoptotischer Zellen mittels TUNEL Technologie. Oli-neu Zellen wurden mit dem siAIF1 Transkript und einem non-sense Transkript als Kontrolle für 2 Tage transfiziert. Die anschließende Behandlung mit 50ng/ml ActA oder 5ng/ml TGF-β1 erfolgte für 20 Stunden. Nach der Fixierung der Proben wurde eine enzymatische TUNEL Färbung durchgeführt. Für die Auswertung wurden GFP positive Zellen gezählt. Im Gegensatz zu TGF-β-behandelten Proben wurde die ActA-induzierte Apoptose durch den AIF knock-down reduziert.