verschiedenen Signalwegen Apoptose
2.1. ActivinA induziert eigenständig Apoptose in einem neuralen System
Für TGF-β1 wurde eine apoptotische Funktion in der oligodendroglialen Vorläuferzelllinie Oli-neu ermittelt. Der TGF-β1-induzierte Zelltod trat ebenfalls in unreifen Oligodendrozyten einer Primärkultur auf87. Um weitere Zelltod-induzierende Zytokine zu ermitteln, wurde ActA auf eine mögliche apoptotische Funktion vergleichend zu TGF-β untersucht. Im Gegensatz zu den TGF-βs mit deren vielfältigen, apoptotischen Funktionen in neuralen Systemen2,6, wurden für Activine noch keine apoptotischen Funktionen im Nervensystem gezeigt12,14.
2.1.1. Eine ActivinA Behandlung führt zur DNA-Fragmentierung in der oligodendroglialen Zelllinie Oli-neu
Zur Überprüfung einer möglichen apoptotischen Funktion von ActA in den Oli-neu Zellen wurde eine PI-FACS-Analyse zur Ermittlung fragmentierter Zellkerne vergleichend zu TGF-β1-behandelten Zellen durchgeführt.
Nach der Behandlung der Oli-neu Zellen mit verschiedenen ActA Konzentrationen oder 5ng/ml TGF-β1 als Positivkontrolle wurden die Zellen in Ethanol fixiert und der Zellkern mit
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Propidiumjodid angefärbt. Mittels der Durchflusszytometrie wurden die Leuchtintensität des gefärbten Zellkerns gemessen und die entsprechende Zellzyklusphase analysiert. Dabei entspricht der sub-G1 Peak (DNA<2n) einem fragmentierten und somit apoptotischen Zellkern. In Abbildung 26A ist die Anzahl apoptotischer Zellen in Prozent dargestellt. In allen eingesetzten Konzentrationen induzierte ActA Apoptose in einem konzentrations-abhängigen Prozess. Die optimale Behandlungsdosis lag bei einer Konzentration von 50ng/ml ActA, bei der eine Apoptoserate von durchschnittlich 32% ermittelt wurde. Diese Konzentration wurde in allen weiteren Experimenten verwendet. In den unbehandelten Proben erschien eine Grundapoptose von 10%. Für die Positivkontrolle (TGF-β1 Behandlung) wurde eine Apoptoserate von ca. 38% gezählt. Bei einer Behandlung der Zellen mit beiden Zytokinen gleichzeitig (ActA 50ng/ml+TGF-β1 5ng/ml), wurde keine Verstärkung der Apoptoserate gemessen (Abbildung 26A).
Als weitere Methode zur Bestimmung der DNA-Fragmentierung wurde die TUNEL Färbung eingesetzt. Eine Behandlung der Zellen mit 50ng/ml ActA führte auch hier zu einem Anstieg apoptotischer Zellen vergleichend zu den Kontrollzellen (Abbildung 26B). TGF-β1-behandelte Kontrollzellen zeigten erneut eine höhere Apoptoserate als ActA-TGF-β1-behandelte Proben.
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Abbildung 26: ActA-induzierte DNA-Fragmentierung in der Oli-neu Zelllinie.
(A) PI-FACS-Analyse von ActA- und TGF-β1-behandelten Oli-neu Zellen zur Bestimmung der apoptotischen Zellzahlen in Abhängigkeit der Zytokinkonzentration. Die Zugabe von 25-100ng/ml ActA oder 5ng/ml TGF-β1 erfolgte für 20 Stunden. Die behandelten Proben wurden geerntet, fixiert und die Zellkerne mit Propidiumjodid angefärbt. Mit einem Durchflusszytometer wurde die Intensität der gefärbten Kerne gemessen (Vierfachbestimmung) und die Zellzahlen gezählt. DNA-Leuchtintensitäten von weniger als 2n geben apoptotische, fragmentierte Kerne an. Die durchflusszytometrischen Messungen ergaben einen Anstieg apoptotischer Zellen in Abhängigkeit der ActA-Konzentration. Dabei stieg die maximale Apoptoserate bei
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50ng/ml ActA Zugabe auf 32% an. TGF-β-Proben dienten als Positivkontrolle. Eine Behandlung der Zellen mit ActA und TGF-β1 gleichzeitig führte zu keiner Verstärkung der Apoptoserate.
(B) TUNEL Färbung von ActA-behandelten (50ng/ml für 20 Stunden) Oli-neu Zellen. Die TGF-β1-Proben dienten als apoptotische Positivkontrolle. Die TUNEL-gefärbten, fluorometrischen Proben wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop bei einer Wellenlänge von 540/590nm analysiert. Es wurde eine deutliche Zunahme der Apoptose in Folge einer ActA Behandlung im Vergleich zur Kontrollprobe ermittelt.
2.1.2. ActivinA induziert keine TGF-β Freisetzung
Da TGF-β in den Oli-neu Zellen Apoptose induzieren kann, musste ausgeschlossen werden, dass die ActivinA Behandlung nicht zu einer TGF-β Freisetzung und somit letztendlich wieder zum TGF-β-induzierten Zelltod führt. Um dies zu überprüfen, wurde ein PAI-Luciferase Assay zur Messung von exogenem TGF-β im Kulturmedium durchgeführt. Dazu wurden Zellen mit ActA behandelt oder unbehandelt im reduzierten Kulturmedium angezogen. Nach 20 stündiger Inkubation wurden die Kulturüberstände mit all den darin enthaltenen Faktoren abgenommen und in den PAI-Luciferase Assay (Material und Methoden, Abschnitt 2.5.3) mit einer Dreifachbestimmung eingesetzt (Abbildung 27A). Die ActA-behandelten Proben zeigten keine vermehrte TGF-β Ausschüttung im Vergleich zu den Kontrollzellen.
Um den TGF-β-involvierten Zelltod weiter auszuschließen, wurde der anti-TGF-β1/2/3 Antikörper eingesetzt. Dieser Antikörper kann alle TGF-β Isoformen im Kulturmedium weg fangen, blockt so exogenes oder freigesetztes TGF-β und verhindert eine TGF-β Signaltransduktion. ActA-induzierte Zellen wurden dazu zusätzlich mit 10µg/ml anti-TGF-β1/2/3 Antikörper behandelt und anschließend mittels PI-FACS-Analyse die Anzahl apoptotischer Zellen bestimmt. Die Apoptose in ActA-behandelten Zellen stieg im Vergleich zu der Kontrolle um 55 % an (Abbildung 27B). Der ActA-induzierte Zelltod wurde nicht mit dem anti-TGF-β1/2/3 Antikörper verhindert. Somit führte eine ActA Behandlung nicht zur Ausschüttung von TGF-β aus den Zellen.
Mit diesen Ergebnissen wurde eine ActA-vermittelte Apoptose neben der TGF-β-vermittelten Apoptose in den Oli-neu Zellen gezeigt. Des Weiteren konnte mit diesem Ergebnis erstmals für Activine eine apoptotische Funktion im Nervensystem bestimmt werden.
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Kulturüberstand und somit zu keiner vermehrten TGF-β zugegeben. Mit einer PI-FACS-Analyse wurde gemessen, ob ActA im Beisein des Antikörpers Apoptose auslösen kann. Im Vergleich zu den Kontrollen führte eine alleinige ActA Behandlung zu einer 55%igen Apoptoserate. Ein Verhindern der TGF-β Signalweiterleitung durch den Antikörper hatte keinen Einfluss auf die ActA-induzierte Apoptose.2.1.3. Der Alk4/5/7 Rezeptorinhibitor blockiert sowohl die ActA- als auch die TGF-β-induzierte Apoptose
Die Induktion des Zelltods auf der Ebene der Rezeptoren wurde mit dem Alk-4/5/7 Inhibitor SB431542 überprüft. Der Inhibitor blockiert sowohl die Activin TypI Rezeptoren Alk-4 und Alk-7, als auch den TGF-β TypI Rezeptor Alk-5, wodurch der Inhibitor nicht zwischen den jeweiligen Zytokinen unterscheiden kann. Zudem wirkt dieser Inhibitor leicht apoptotisch auf die Zellen (Abbildung 28). Die Proben wurden mit 10µM Alk-4/5/7 Inhibitor für 2 Stunden vorbehandelt und für PI-FACS-Analysen mit ActA (50ng/ml) oder TGF-β1 (5ng/ml) für 20 Stunden weiterbehandelt. Der Alk4/5/7 Inhibitor reduzierte sowohl die TGF-β1-induzierte Apoptose als auch die ActA-induzierte Apoptose auf das Level der Kontrollzellen (Abbildung
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28). Durch die fehlende Spezifität des Inhibitors wurde jedoch nur ermittelt, dass die TGF-β-induzierte Apoptose über den Alk-5 Rezeptor und die ActA-TGF-β-induzierte Apoptose über den
Oli-neu Zellen wurden zusammen mit dem Alk4/5/7 Inhibitor SB431542 und 50ng/ml ActA oder 5ng/ml TGF-β1 für 20 Stunden ko-inkubiert oder alleine mit den Zytokinen behandelt. Mit der PI-FACS-Analyse wurde die Anzahl apoptotischer Zellen nach der jeweiligen Behandlungen bestimmt. SB431542 reduziert die ActA-induzierte Apoptose und die TGF-β1-induzierte Apoptose signifikant auf das Level der Kontrollprobe.