Die Regulation von Genen in Plastiden und Mitochondrien galt zu Beginn dieser Arbeit als ei-ne sehr vielversprechende mögliche Funktion von Cryptochrom 3 inArabidopsis thaliana. Für cryDASH ausSynechocystiswurde von Brudler et al. (2003) durch einemicroarray Analyse gezeigt, dass die Regulation einiger Gene in der cryDASH-Mutante verändert ist. Zudem ist cryDASH inSynechocystisan der Induktion von psbA zurde novoD1-Protein-Synthese betei-ligt. Hohe Lichtintensitäten und UV-Licht führen besonders zu einer Schädigung der D1- und D2-Proteine im Reaktionszentrum von Photosystem II. Um eine erhöhte Neusynthese des D1-Proteins zu gewährleisten, wird daher inSynechocystisdie psbA-Expression durch UV-B Strahlung, aber auch durch UV-A und sichtbares Licht deutlich induziert (Máté et al., 1998;
Vass et al., 2000). In der Synechocystis cryDASH-Mutante ist diese Transkript-Induktion da-gegen vor allem bei UV-B- und UV-A-Bestrahlung deutlich reduziert (Kleine, 2003). Eine ähn-liche regulatorische Funktion wäre also ebenso für cry3 aus Arabidopsis denkbar. Auch die beschriebene DNA-Bindung durch cry3 würde zu einer Funktion als Transkriptionsregulator passen.
Bei Arabidopsis wurde bisher vor allem die blaulichtspezifische Regulation des psbD-Gens durch den Sigma-Faktor 5 untersucht (Thum et al., 2001; Tsunoyama et al., 2004; Mochizu-ki et al., 2004). Auch die Transkription anderer chloroplastenkodierter Gene wird durch Licht
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reguliert. Die Expression von psbA, rbcL und 16 S rDNA wird in den Blättern vonArabidopsis vor allem durch UV-A und Blaulicht induziert (Chun et al., 2001). Für die psbA-Transkript-Induktion konnte dabei eine Beteiligung von Phytochrom A nachgewiesen werden. Dagegen scheint die rbcL-Expression zumindest im Blaulicht nicht durch phyA reguliert zu werden.
Auch eine Regulation durch cry1 und phyB wurde ausgeschlossen. In dieser Arbeit wurde daher überprüft, ob Cryptochrom 3 bei der UV-A / Blaulicht-spezifischen Transkript-Induktion in Chloroplasten eine Rolle spielt. Für die rbcL- und psaA-Transkripte konnte in dunkelad-aptierten Pflanzen nach UV-A-Bestrahlung eine ähnliche Transkript-Induktion nachgewiesen werden, wie sie von Chun et al. (2001) beschrieben wurde. Weder der knock-out, noch die Überexpression von cry3 hat jedoch einen Einfluss auf diese Regulation der untersuchten Chloroplastengene. Cryptochrom 3 scheint demnach zumindest in adulten Blättern nicht an der Transkriptionsregulation durch UV-A und Blaulicht in den Plastiden beteiligt zu sein. Weite-re vorläufige Ergebnisse zur Induktion der Plastidentranskripte durch Rotlicht zeigen, dass die Expression von rbcL und psaA auch durch Bestrahlung mit Rotlicht induziert werden kann.
Die psbD-Expression wird durch Rotlicht dagegen kaum beeinflusst (Abbildung 45 im An-hang). Diese Ergebnisse lassen sich gut mit der plastidären Genregulation durch kernko-dierte Sigma-Faktoren erklären. Scheinbar werden rbcL und psaA unter diesen Bedingungen hauptsächlich durch AtSIG1 reguliert. Dieser Sigmafaktor wird in Blättern von dunkeladap-tierten Pflanzen sowohl durch Blaulicht, als auch durch rotes Licht induziert (Onda et al., 2008). PsbD wird dagegen, wie bereits mehrfach eingehend untersucht wurde, durch den blaulichtspezifischen Sigma-Faktor 5 reguliert. Obwohl die hier untersuchten Plastidengene anscheinend durch Sigma-Faktoren reguliert werden, lässt sich eine Beteiligung von cry3 bei der blaulichtspezifischen Transkript-Induktion anderer Gene nicht vollständig ausschließen.
Eine generelle Funktion von cry3 bei der Lichtregulation der plastidären Gene unter diesen Bedingungen ist allerdings eher unwahrscheinlich.
Wie einemicroarray Studie von Ulm et al. (2004) ergab, ist Cryptochrom 3 eines von insge-samt nur 100 Genen, die bereits nach 1 h durch langwellige UV-B-Strahlung induziert werden.
Diese Daten sprechen für eine mögliche Funktion von cry3 bei der UV-B-vermittelten Signal-transduktion. Durch eine weitere Analyse der veröffentlichtenmicroarray Daten wurde deut-lich, dass die meisten plastidenkodierten Gene vor allem durch eine Bestrahlung mit kurzwel-liger UV-B-Strahlung herunterreguliert werden. Die Transkriptmengen dieser Gene verringern sich dabei um 50-80%. Daher wurde in dieser Arbeit untersucht, ob cry3 möglicherweise als Photorezeptor oder Teil einer Signaltransduktionskette an der UV-B-vermittelten Reduktion der Chloroplastentranskripte beteiligt ist. Die UV-B-vermittelte Reduktion der plastidären Tran-skripte konnte durch realtime PCR-Experimente bestätigt werden. Ebenso wie die microar-ray Daten zeigen dierealtimePCR-Ergebnisse, dass die psaA- und rps11-Transkriptmengen nach UV-B-Bestrahlung um jeweils 70% bzw. 60% reduziert werden. Diese Regulation er-folgt allerdings ebenso in der cry3-knock-out-Mutante (Abbildung 24). Eine Beteiligung von cry3 an dieser Regulation der untersuchten plastidären Transkripte ist somit ebenfalls
aus-zuschließen. Da die Reduktion der Plastidentranskripte hauptsächlich erst längere Zeit nach der Behandlung mit kurzwelliger UV-B-Strahlung erfolgte, kann zudem nicht ausgeschlossen werden, dass diese Reaktion nicht durch einen UV-B-Photorezeptor, sondern durch die Ak-kumulation von UV-Schäden in der Pflanzenzelle ausgelöst wird.
Auch grünes Licht hat Auswirkungen auf die Expression von plastidenkodierten Genen. Durch einen kurzen Grünlicht-Puls von nur 10 µmol m-2 wird ein Großteil der Transkripte in den Chloroplasten um 50-70% reduziert (Dhingra et al., 2006). Die Analyse von Mutanten zeigte, dass weder Cryptochrom 1 und 2, noch die Phototropine an dieser Reaktion beteiligt sind.
Auch phyA und phyB wurden als verantwortliche Photorezeptoren ausgeschlossen (Dhin-gra et al., 2006). Die Abnahme der Transkriptmengen könnte entweder durch eine verrin-gerte Transkription der Gene verursacht werden, oder durch eine Destabilisierung und den Abbau der vorhandenen Transkripte. Für eine mögliche Beteiligung von Cryptochrom 3 an dieser Grünlicht-induzierten Transkriptreduktion spricht zunächst die Lokalisation von cry3 in den Chloroplasten. Des Weiteren scheint außer cry3 kein Photorezeptor auf Transkriptebene durch Grünlicht reguliert zu werden. Der verwendete Grünlichtpuls von 10 s führte zu einer Induktion der CRY3-Transkriptmenge um das 5-fache (Abbildung 25 B und Dhingra et al., 2006). Für die “klassischen” Cryptochrome cry1 und cry2 aus Arabidopsis thaliana wurde bereits eine inhibitorische Wirkung von grünem Licht auf deren Aktivität beschrieben (Bouly et al., 2007; Banerjee et al., 2007). Auch cry3 könnte daher eine ähnliche Grünlicht-Antwort in den Chloroplasten auslösen und somit die Transkriptmengen in den Plastiden beeinflussen.
Durch die Untersuchung von WT-Pflanzen undcry3-Mutanten mittels realtimePCR-Analyse konnte jedoch kein Einfluss von Cryptochrom 3 auf die Grünlicht-spezifische Transkriptreduk-tion in Chloroplasten nachgewiesen werden. Zunächst erbrachte die Analyse von verschie-denen plastidären Genen kein eindeutiges Ergebnis, da die gemessenen Transkriptmengen bei unabhängigen Experimenten eine relativ große Variabilität ergab. Die Reaktion hinsicht-lich der Menge der Plastidentranskripte auf den Grünhinsicht-lichtpuls war relativ schwach, so dass bei WT-Pflanzen unter den verwendeten experimentellen Bedingungen nur eine Reduktion der Transkripte um maximal 50% gemessen werden konnte. Auch die geringe Photonenflu-enz, die für diese Reaktion benötigt wurde, erschwerte eine genaue und reproduzierbare Dosierung des eingestrahlten Grünlichts. Für die weitere Analyse der Grünlicht-Antwort wur-den daher die relativen Transkriptmengen des psaA-Gens durch 7 unabhängige Experimente bestimmt. Zusammengefasst belegen diese Experimente, dass das psaA-Gen in der cry3-Mutante ebenso wie im WT durch Grünlicht reguliert wird. Auch an dieser Lichtregulation von plastidären Genen scheint cry3 somit nicht beteiligt zu sein.
Obwohl für cry3 anhand der durchgeführten Experimente also keine Funktion bei der Regu-lation von plastidenkodierten Genen nachgewiesen werden konnte, kann eine regulatorische Funktion von cry3 bei bestimmten Genen oder unter bestimmten Bedingungen letztendlich nicht völlig ausgeschlossen werden. Um einen möglichen Einfluss von Cryptochrom 3 auf die Transkription von plastidären, aber auch von mitochondrialen und nukleären Genen zu
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untersuchen, wäre daher die Durchführung vonmicroarray Experimenten zum Vergleich von WT-Pflanzen und cry3-Mutanten sinnvoll. Allerdings könnte auch bei diesen Experimenten eine mögliche cry3-Funktion unentdeckt bleiben, da cry3-spezifische Regulationsvorgänge möglicherweise nur unter sehr speziellen Bedingungen oder während bestimmter Entwick-lungsstadien der Pflanzen stattfinden.
4.6 Ein Einfluss von cry3 auf die Samenkeimung kann nicht völlig