Mutanten und transgene Linien
Beschreibung Hintergrund Quelle
cry3ox Überexpressionslinie cry3 Ler diese Arbeit CRY3 RNAi CRY3-RNAi-Linie
(CRY3-Menge reduziert)
Col diese Arbeit
∆cry3 cry3-Transposoninsertion (knock-out)
Nos Riken Institut, Japan 5’ T-DNA T-DNA-Insertion im
CRY3-Promotorbereich
Col-0 Koncz, MPIZ Köln GK (T-DNA) T-DNA-Insertion im letzten
CRY3 Exon (423F01)
Col-0 GABI-Kat, NASC pif1-2 pif1knock-out-Linie Col-0 Prof. Apel, Zürich
∆phr Klasse II CPD-Photolyase knock-out
Ler ABRC, Landry et al., 1997 phr ox Klasse II
CPD-Photolyase-Überexpressionslinie
Ler Kaiser et al., 2009
2 MATERIAL UND METHODEN 42
Keimlingen heranwachsen konnten. Die Ernte der Keimlinge erfolgte nach entsprechender Wachstumszeit von meist 3-5 Tagen. Die Keimlinge wurden dazu mitsamt dem Filterpapier in flüssigem Stickstoff gekühlt, um dann mit einem vorgekühlten Spatel abgekratzt zu werden.
Um ein zwischenzeitliches Auftauen der Keimlinge zu verhindern, wurde ein Stück Alumini-umfolie mit flüssigem N2gefüllt und die Keimlinge fielen bei der Ernte vom Filterpapier direkt in den Stickstoff. Direkt nachdem der Stickstoff abgedampft war, wurden die Keimlinge in der Folie eingeschlossen und erneut im Stickstoff gekühlt und bei -70°C gelagert.
Anzucht auf Platten Arabidopsis-Keimlinge wurden ebenfalls auf 12MS Phytoagar-Platten angezogen. Für 500 ml MS-Medium wurde 1,075 g MS und 0,25 g MES zunächst in 400 ml H2O gelöst und mit 1 M KOH-Lösung auf pH 5,7 eingestellt. Nach Zugabe von 4 g Phytoagar wurde das Medium auf 500 ml aufgefüllt und für 20 min autoklaviert. Bei Verwendung der Platten zur Selektion mit Hygromycin wurde dem Medium nach dem Autoklavieren 200 µl einer sterilfiltrierten Hygromycin-Lösung (50 mgml) zugegeben. Die Endkonzentration betrug somit 20µgml. Nachdem das Medium auf ca. 60°C abgekühlt war, wurden die Platten gegossen.
Vor der Aussaat wurden die Samen, wie in Abschnitt 2.2.2 beschrieben, oberflächensterili-siert, in 0,15% Phytoagar resuspendiert und mit einer Pipette auf den Platten verteilt. Die geöffneten Platten wurden in der Sterilbank kurz getrocknet, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Schließlich wurden die Platten mit Parafilm verschlossen und nach Stratifikation bei 4-6°C den entsprechenden Wachstumsbedingungen ausgesetzt.
Bestrahlungsbedingungen Vom Weißlicht abweichende Bestrahlungsprogramme wurden meistens unter Verwendung von Lichtfeldern durchgeführt. Folgende Lichtfelder wurden in dieser Arbeit verwendet (Schäfer, 1977):
Lichtfeld λ(max) HW (spektrale Bandbreite) Fluenzrate
Blaulicht-Feld 436 nm 43 nm 40 µmol m-2s-1
Rotlicht-Feld 656 nm 24,5 nm 21 µmol m-2s-1
Dunkelrot-Feld 730 nm 128 nm 6 µmol m-2s-1
UV-A 360 nm 40 nm 70 µmol m-2s-1
UV-B Lampen: Philips TL 40W / 12 (280-350nm)
Zur monochromatischen Bestrahlung von Proben wurden Doppel-Interferenz-Linienfilter (Schott, Mainz) im Strahlengang von Diaprojektoren verwendet. Die Lichtintensität wurde dann den Anforderungen entsprechend eingestellt. Die Fluenzraten von monochromatischen Lichtquel-len wurden mit einem Optometer von Gigahertz optik (model BN-9201.2-TF) bestimmt. Zur Messung der Lichtintensität von Weißlichtquellen wurde ein LI-COR LI-185B Lichtmessgerät verwendet.
2.2.2 Oberflächensterilisation von Samen
UmArabidopsis-Pflanzen auf Agar-Platten anzuziehen, wurde die Oberfläche der Samen zu-vor sterilisiert. Dadurch wurde eine Kontamination der Platten mit Pilzen oder Bakterien ver-hindert. Zur Sterilisation wurde eine entsprechende Menge Samen zunächst mit 70%igem Ethanol und dann für 10 min mit Sterilisations-Lösung (5% Hypochlorit; 0,1% Triton X-100) in 1,5 ml Reaktionsgefäßen gewaschen. Die Samen sedimentieren nach kurzer Zeit selbstän-dig, so dass der Überstand mit einer Pipette abgenommen werden konnte. Um alle Reste der Sterilisationslösung wieder zu entfernen, wurden die Samen anschließend 3x mit steri-lem Wasser gewaschen. Zur Aussaat wurden die Samen schließlich in einer sterilen 0,15%
Phytoagar-Lösung resuspendiert. Die Samen wurden in dieser Lösung mit einer Pipette auf die Platten verteilt.
Da die Samen für die Keimungsexperimente vor der Aussaat nicht quellen durften, wurden sie in diesem Fall für 10 min mit 100%igem Ethanol gewaschen. Nach dem Abnehmen des Ethanols wurden die Samen in der Sterilbank an der Luft getrocknet und später direkt für die Aussaat auf die Wasser-Agar-Platten für die Keimungsversuche verwendet.
2.2.3 Keimungsversuche
Nachzucht für Keimungsversuche Die Wachstumsbedingungen der Mutterpflanzen, das Alter der Samen und die Art der Samenlagerung haben einen großen Einfluss auf die Kei-mungsfähigkeit der Samen. Um geeignete Samen für die Keimungsversuche mitArabidopsis thaliana zu erhalten, mussten die Mutterpflanzen der einzelnen Pflanzenlinien alle zur glei-chen Zeit und unter identisglei-chen Bedingungen angezogen werden. Auch die Samen wurden gleichzeitig geerntet und unter gleichen Bedingungen gelagert.
Von jeder zu untersuchenden Pflanzenlinie wurden 6-8 Einzelpflanzen angezogen. Die Sa-men dieser Pflanzen wurden separat geerntet und für eine unabhängige Mehrfachbestim-mung der einzelnen Linien verwendet. Die Ernte der Samen erfolgte sobald die Schoten der Pflanzen getrocknet waren und eine braune Farbe angenommen hatten. Die Samen wurden vom restlichen Pflanzenmaterial durch ein Sieb mit 200 µm Maschenweite getrennt. Zudem wurden kleine und unterentwickelte Samen durch ein 50 µm Sieb abgetrennt und verworfen.
Die Samen wurden in 1,5 ml Reaktionsgefäßen gesammelt und bis zur Aussaat im Dunkeln bei 4°C gelagert.
Aussaat und Keimung Die oberflächensterilisierten Samen (Abschnitt 2.2.2) wurden für die Keimungsversuche auf 0,9% Phytoagar-Platten ohne weitere Zusätze ausgesät. Jeweils 30 - 100 Samen von 6 einzelnen Mutterpflanzen wurden für jede Pflanzenlinie verwendet.
Jede Platte wurde unterteilt, so dass pro Platte 6 unterschiedliche Samen-Chargen ausgesät wurden. Um den Einfluss von kleinen Unterschieden einzelner Platten auf die
Samenkei-2 MATERIAL UND METHODEN 44
mung auszuschließen, wurden die Samen der unterschiedlichen Pflanzenlinien gleichmäßig auf mehrere Agar-Platten verteilt. Direkt nach der Aussaat wurden die Samen für 1 h dun-kel gestellt und anschließend für 4 min mit monochromatischem Dundun-kelrot-Licht (750 nm; 11 µmol m-2 s-1) bestrahlt. Dadurch wird die aktive PFR-Form von Phytochrom B in den Samen reduziert und somit wird die Dunkelkeimung auf ein Minimum reduziert. Die Samen wurden direkt nach der DR-Bestrahlung lichtdicht verpackt und für 3 Tage bei 4-6°C stratifiziert. Nach dieser Zeit erfolgte die Induktion der Samenkeimung mit dem jeweiligen Lichtprogramm. Die Keimungsrate wurde nach weiteren 4 Tagen bei 18°C bestimmt. Alle Samen, bei denen die Samenschale bereits von der Radicula durchbrochen worden war, wurden als gekeimt gewer-tet.
2.2.4 Bestimmung der Pigmentzusammensetzung
Chlorophyll-Bestimmung durch Absorptionsspektroskopie Zur Chlorophyll-Bestimmung wurden die Pigmente ausArabidopsis Keimlingen oder adultem Blattmaterial mit N,N’-Dime-thyl-Formamid (DMF) extrahiert. Dazu wurde das Material für ca. 2 h in 1 ml DMF im Dunkeln geschüttelt, bis die Pigmente vollständig extrahiert waren. Der Pigment-Extrakt wurde mit ei-ner Pipette entnommen und in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Von diesen Extrakten wurden dann Absorptionsspektren im Bereich von 350 bis 720 nm aufgenommen. Unter Ver-wendung der einzelnen Extinktionskoeffizienten lässt sich aus den Spektren mit folgenden Formeln nach Porra (2002) die Menge von Chlorophyll A und B bestimmen:
• Chl a [mg/l Lösungsmittel] = 12,00 x E663,8– 3,11 x E646,8
• Chl b [mg/l Lösungsmittel] = 20,78 x E646,8– 4.88 x E663,8
• Chl a + b [mg/l Lösungsmittel] = 17,67 x E646,8+ 7,12 x E663,8
Pigment-Bestimmung durch Fluoreszenzspektroskopie Die Pigmentzusammensetzung in etiolierten Arabidopsis Keimlingen wurde durch Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Im Gegensatz zur Absorptionsspektroskopie weist die Fluoreszenzspektroskopie eine wesentlich höhere Sensitivität auf. Dadurch konnte die Pigmentzusammensetzung in einem DMF-Extrakt aus nur 10 etioliertenArabidopsisKeimlingen analysiert werden. Bei einer Anregungswellen-länge von 433 nm wurde ein Emissionsspektrum im Bereich von 600 bis 720 nm aufgenom-men. Das Emissionsmaximum von Protochlorophyllid beträgt 624 nm, Chlorophyll hat sein Emissionsmaximum dagegen bei 663 nm. Daher kann man durch Fluoreszenzspektroskopie die Umwandlung von Protochlorophyllid zu Chlorophyll in etiolierten Keimlingen gut beobach-ten.
2.2.5 Bestimmung der Hypokotyllänge und Kotyledonenfläche
Zur Messung der Hypokotyllänge und Kotyledonenfläche wurden die Keimlinge bzw. Kotyle-donen inklusive einem Längenstandard mit einer Digitalkamera fotografiert. Die Längen der Hypokotyle und die Flächen der Kotyledonen wurden dann anhand des Längenstandards mit dem ProgrammImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) quantifiziert. Aus ca. 15 Einzelmessungen wurde der Mittelwert und die Standardabweichung berechnet.
2.2.6 Elektronenmikroskopie
Für die Elektronenmikroskopie wurden 7 Tage alte Arabidopsis Keimlinge in 1% Glutaral-dehyd fixiert. Durch Anlegen eines Unterdrucks im Exsikkator wurden kleine Luftbläschen entfernt, so dass die Keimlinge in der Glutaraldehyd-Lösung nach unten sanken. Nach der Entwässerung des Gewebes mit einer aufsteigenden Ethanolreihe erfolgte die Einbettung in Lowicryl Harz. Mit einem Microtom wurden daraus schließlich Ultradünnschnitte angefertigt.
Diese Schnitte wurden mit dem affinitätsgereinigten cry3-Antikörper #503 (Meier, 2004) in ei-ner 1:50 Verdünnung inkubiert. Zur Detektion erfolgte eine weitere Inkubation mit goldgekop-peltem Senkundärantikörper (1:150) gegen Kaninchen Immunglobuline. Die Proben wurden dann mit dem Elektronenmikoskop analysiert.