Regulation der NGF-Signalkaskade durch die CMD- CMD-Komponente Cholesterin

Cholesterin ist nicht nur ein wichtiges Strukturelement in der Plasmamembran und im Myelin, sondern es spielt auch als Komponente von CMD eine Rolle bei der Signalgebung (MARTIN et al., 2005). Die Wechselwirkungen zwischen Caveolin-1 und Cholesterin wurden erstmals von Rothberg erwähnt. Er beobachtete, dass Zellen, die mit Cholesterin-bindenden Reagentien (z.B. Filipin, Nystatin) behandelt wurden, ein morphologisches Abflachen der Caveolae zeigten (ROTHBERG et al., 1992). Die Palmitoylierung von Caveolin-1 an den Positionen 143 und 156 ermöglicht die direkte Bindung an Cholesterin (FIELDING 1995).

Cholesterin ist mit einem Lipidanteil von 30% ein wichtiger Bestandteil des ZNS. Da Cholesterin nicht durch die Blut-Hirn-Schranke gelangt, muss die Synthese im ZNS endogen erfolgen. Zu den Hauptproduzenten von Cholesterin im ZNS gehören gliale Zellen, von denen auch OL befähigt sind Cholesterin selber zu synthetisieren.

Außerdem können OL in vitro nach Gabe von PEG-600 Cholesterin für 24 h ihren intrazellulären Cholesteringehalt um über 50% erhöhen. Durch Exposition mit Fluorescein-gekoppeltem PEG-Cholesterin ließ sich die Cholesterinaufnahme in primären Schweine-OL nachvollziehen. Dabei reicherte sich Cholesterin nach 15 min zunächst in der Plasmamembran an. Etwa 24 h später kam es zu einer Aggregation von Cholesterin im cytosolischen Bereich; wahrscheinlich innerhalb des Golgi-Apparates oder des Endoplasmatischen Reticulums.

Eine Erhöhung des zellulären Cholesterinspiegels in Schweine-OL führte nach 48 h zu einem Anstieg der Caveolin-1-Expression, wodurch es wahrscheinlich auch zu einer Zunahme von CMD kam. Außerdem begünstigt Cholesterin das Fortsatzwachstum in Schweine-OL, was nach 48-stündiger Cholesterin-Exposition primärer OL zu beobachten war und auf eine effektivere Signalweiterleitung zurückzuführen ist.

Die Regulation der Caveolin-1-Expression durch Cholesterin erfolgt dabei auf Transkriptionsebene über zwei reglatorische Bindungsstellen am Caveolin-1 Promotor.

Fielding entdeckte, dass aus einem Ansteigen des zellulären Cholesterinspiegels eine zunehmende Caveolin-1-mRNA-Synthese resultiert; der entgegengesetzte Effekt tritt nach Cholesterin Wegnahme (FIELDING et al., 1994; BIST et al., 1997), die in MDCK-Zellen zu einem Rückgang der Caveolin-Expression sowie zu von Verlust von CMD führt, auf (HAILSTONES et al., 1998).

Gibt man Cholesterin zusammen mit NGF auf primäre Schweine-OL, so ergänzen sich beide Einzeleffekte bei der Förderung des Fortsatzwachstums. Denn nach 24 h besaßen diese Zellen wesentlich mehr Fortsätze als nach alleiniger NGF-Exposition. Der Vergleich der MAPK-Aktivität beider Proben, die ein Indikator für die Intensität des Fortsatzwachstums ist, bestätigte diesen Befund. Wahrscheinlich erleichtert Cholesterin neben der Genese von CMD auch die Dimerisierung und die Autophosphorylierung von TrkA in CMD.

In vitro kann der zelluläre Cholesterinspiegel in Schweine-OL mittels Methyl-ß-Cyclodextrin um ca. 60% reduziert werden. Ein über mehrere Tage anhaltender Cholesterinmangel führte dazu, dass die Zellen ihre Fortsätze einzogen und dazu neigten, größere Zellhaufen auszubilden; diese ließen sich durch Cholesteringabe wieder auflösen. Außerdem setzte kurz nachdem die Zellen ihren Cholesterinmangel behoben hatten das Fortsatzwachstum wieder ein.

Eine abrupte Cholesterinreduktion führt zu einer Zerstörung von CMD (THORN et al., 2003). Daraufhin gelangen Signalrezeptoren und Proteine aus den Mikrodomänen in die umliegende Plasmamembran. Erkennbar wird dieses Phänomen daran, dass es nach Methyl-ß-Cyclodextrin-Inkubation der Zellen zu einer Zunahme von Detergens-löslichem TrkA, bzw. nach Pike zu einer Verlagerung der Signalkomponenten aus der

“Low density-Fraktion“ in Fraktionen höherer Dichte kommt (PEIRO et al., 2000).

Auf diese Weise ließen sich in vitro Bedingungen schaffen, unter denen sich TrkA vorwiegend außerhalb von CMD befindet. Dabei zeigte sich, dass die Translokation von TrkA aus den CMD heraus die NGF-Signalgebung weniger effizient macht, da die

Signalweiterleitung innerhalb von CMD offenbar durch die Bildung stabilerer Signalkomplexe begünstigt wird. Eine Abschwächung des Fortsatzwachstums bei Wegnahme von Cholesterin ließ sich direkt anhand der Intensität der MAPK-Aktivierung nach Gabe von NGF detektieren, die deutlich unter dem normalen Aktivitätsanstieg blieb.

In PC12-Zellen bewirkt die Gabe von Cholesterin-bindenden Reagentien ebenfalls eine Hemmung der MAPK-Aktivität und eine Erschwerung der Autophosphorylierung von TrkA (HUANG et al., 1999; PEIRO et al., 2000).

Diese Ergebnisse stimmen mit anderen Studien, die sich ebenfalls mit CMD-assoziierten Wachstumsrezeptoren beschäftigen, überein. Aus einer Cholesterinreduktion resultiert eine deutlich herabgesetzte Rezeptor-Funktion in der Signalgebung. Beispiele sind der PDGF-Rezeptor (LIU 1997) und der Insulin-Rezeptor (IRS) (VAINIO et al., 2002). Die beschriebenen Auswirkungen eines Cholesterinmangels sind nicht auf das ZNS beschränkt. In diesem Zusammenhang beobachtete Mikol, dass es bei einem Cholesterinmangel auch im PNS zu einer Demyelinisierung von Schwann Zellen kommt (MICOL et al., 2002).

Eine gegenteilige Beobachtung wurde beim EGF-Rezeptor beschrieben, der nach Stimulation mit EGF aus CMD heraus verlagert wird. Hier bewirkt die Gabe von Methyl-ß-Cyclodextrin (1-2%) daher eine Hyperaktivierung der MAPK (FURCHI et al., 1998; CHEN et al., 2001), weil eine Translokation des EGF-Rezeptors aus CMD heraus begünstigt wird. Auf der anderen Seite hemmt die Gabe von Cholesterin die Bindung von EGF und damit die Aktivierung des EGF-Rezeptors (RINGERIKE et al., 2001), der sich im inaktiven Zustand innerhalb von CMD befindet.

Diesen Resultaten zur Folge ist der TrkA-Rezeptor in der Signalgebung dem PDGF- und Insulin-Rezeptor wesentlich ähnlicher als dem EGF-Rezeptor.

4.7.1 Erfolgt eine indirekte Modulation der NGF/TrkA Signalkaskade via Caveolin-1 über die Cholesterin Homöostase?

Obwohl Cholesterin ein wichtiger Bestandteil von Myelinmembranen ist, der die Myelinbildung begünstigt, ist bis heute nur sehr wenig über den genauen Ablauf des Cholesterin-Stoffwechsels in OL bekannt. Nachdem bislang immer nur eine direkte Regulation der NGF/TrkA durch Caveolin diskutiert wurde, könnte in OL auch ein indirekter Regulationsmechanismus zum Tragen kommen, bei dem Caveolin-1 über

Regulation der Cholesterin Homöostase die NGF/TrkA-Signalkaskade ebenfalls beeinflussen kann:

Eine direkte Involvierung von Caveolin-1 bei der Regulation des Cholesteringleichgewichtes der Zelle verdeutlicht die Tatsache, dass ein Caveolin-1-Knock-down mittels siRNA einen deutlichen Cholesterinanstieg von über 50% in OL mit sich bringt, was zeigt, dass die Cholesterin Homöostase gestört ist, da offenbar ein wichtiger Transportmechanismus zum Erliegen kam.

Aus einer andauernden NGF-Exposition resultiert wie bereits erwähnt ein drastischer Anstieg der Caveolin-1-Expression; auf der anderen Seite nimmt der zelluläre Cholesterinspiegel deutlich ab. Daher bestünde ein möglicher Regulationsmechanismus darin, dass Caveolin-1 bei Überexpression im verstärkten Maße Cholesterin herunterreguliert, was sich schließlich negativ auf die Signalgebung auswirkt und sie so abschwächt, da ein Cholesterinmangel aller Voraussicht nach mit einer Abnahme von CMD verbunden ist.

Ein vergleichbarer Mechanismus wurde bereits bei NIH3T3-Fibroblasten postuliert (ROY et al., 1999). Hier inhibiert Caveolin unter Reduktion des Cholesterinspiegels in der Plasmamembran die Aktivierung von Raf durch H-Ras. Bei Zugabe von Cholesterin unterbleibt die Hemmung.