Cholesterinanstieg nach Caveolin-1 Knock-down
1) Kontrolle: Zellen wurden mit NS-siRNA transfiziert [= 100%]
4.4 NGF-bedingte Einflüsse auf Caveolin-1/CMD
4.4.1 Hochregulation der Caveolin-1-Expression durch NGF
Ein weiteres Argument für eine Abhängigkeit der NGF/TrkA-Signalgebung von Caveolin-1/CMD lieferte die Untersuchung des regulatorischen Einflusses von NGF auf die Caveolin-1-Genexpression. Die Stimulation von Schweine-OL mit NGF führte zu einer 2-3-fachen Hochregulation von Caveolin-1, die auf mRNA- sowie auf Proteinebene nach 48 h gezeigt werden konnte.
Eine ähnliche Beobachtung über eine Erhöhung der Caveolin-Expression machte Galbiati an PC12-Zellen, wenn sie für vier Tage mit NGF behandelt wurden (GALBIATI et al., 1998).
Der Grund für die gesteigerte Caveolin-1-Expression unter NGF könnte ein negativer regulatorischer Rückkopplungsmechanismus sein, über den eine Zelle die unkontrollierte Ausweitung ihrer Signaltransduktion verhindert. Als Beispiel hierzu wäre die Funktion des Caveolins als Suppressorprotein bei der Entstehung von Tumoren zu nennen. Entartete Kebszellen verfügen nämlich über keine bzw. nur über eine geringe Caveolin-1-Expression (RAZANI et al., 2001).
Ebenfalls denkbar wäre, dass eine erhöhte Caveolin-1-Expression mit einer größeren Anzahl an CMD verbunden ist (FAN 1983; LEE et al., 2005), wodurch die Signalweiterleitung von TrkA innerhalb von CMD optimiert und ausgeweitet werden kann. Zum Beispiel spielt Caveolin-1 im PNS nach Mikol eine wichtige Rolle bei der Signalgebung, die zur Myelinisierung von Schwann Zellen führt; und zwar steigt die Caveolin-1-Expression in Schwann Zellen während der Myelinisierung an, dagegen
nimmt sie beim Demyelinisierungsprozess wieder ab (MIKOL et al., 1999, 2002). Bei Betrachtung aller Ergebnisse scheint es jedoch in Schweine-OL bezüglich der vorhandenen Menge eine Art “Schwellenwert“ zu geben: Liegt die Caveolin-1-Konzentration innerhalb eines “Toleranzbereiches“, so erreicht die Intensität der Signalgebung ihr Optimum. Wird dieser Bereich unterschritten, funktioniert die Signalweiterleitung aufgrund einer zu geringen Anzahl von CMD nicht optimal.
Dagegen kann Caveolin-1 bei Überschreitung dieses Schwellenwertes auch als Suppressor wirken.
4.4.2 NGF-induzierte Caveolin-1 Phosphorylierung an Tyrosin-14 (Caveolin pY14)
Caveolin-1 ist an der Organisation von Signalkomplexen beteiligt und kann zudem direkt in Signalkaskaden involviert sein, indem es als Substrat für Tyrosin- und Serin/Threoninkinasen dienen kann. Eine dieser Phosphorylierungsstellen von Caveolin-1 befindet sich am aminoterminalen Ende an Tyrosin-14. Allerdings besitzt nur die Caveolin-1α-Isoform diese Phosphorylierungsstelle, da der ß-Form die ersten 30 AS an diesem Terminus fehlen. Durch einen spezifischen Antikörper, der speziell gegen Caveolin-phosphoryliertes Tyrosin-14 gerichtet ist, konnte in Schweine-OL nach NGF-Gabe eine ca. 4-5 fache Zunahme der Caveolin pY14 detektiert werden; unbehandelte Zellen wurden dagegen nur auf einem geringen Grundlevel phosphoryliert. Die Caveolin pY14 setzte nach 10 min ein und erstreckte sich auf die gesamte Zelle und ihre Fortsätze. Allerdings existieren stärker und schwächer fluoreszierende Bereiche, die zeigen, dass die Caveolin pY14 nicht gleichmäßig und homogen innerhalb der Zelle abläuft. In der Plasmamembran und in den Bereichen, wo es zum Zell-Zell-Kontakt kommt, findet eine Akkumulation der Caveolin pY14 statt (LEE et al., 2000). Zu den beiden Hauptauslösern von Caveolin pY14 gehören zellulärer Stress und die Stimulation mit Wachstumsfaktoren (LI et al., 1996a; LEE et al., 2000; VOLONTE et al., 2001). Auch hierbei wurde eine geringe Caveolin pY14 in unbehandelten Zellen beobachtet (NOMURA et al., 1999). Da Caveolin-1 eine Rolle bei der Insulin- (KIMURA et al., 2002) und der EGF-Signalgebung spielt, wurde von Lee die Caveolin pY14 in diesen beiden Signalkaskaden, die ebenfalls Tyrosinkinase Rezeptor-gesteuert sind, näher durchleuchtet (LEE et al., 2005). Anhand einer Fibroblasten-Zelllinie, die mit Insulin behandelt wurde, entdeckte Lee eine Phosphorylierungszunahme von
Caveolin-1 (LEE et al., 2005). Nach Corley-Mastick tritt die Caveolin pY14 bei Gabe von Insulin nach nur einer Minute auf (CORLEY-MASTICK 1995) und erreicht 5 min später ihr Maximum. Bei der Stimulation des EGF-Rezeptors in Epithelzellen beobachtete Orlichenko nach 20-minütiger EGF-Behandlung eine 8-10 fache Zunahme der Caveolin pY14 (ORLICHENKO et al., 2005).
Beide Arbeitsgruppen stimmen darin überein, dass in ihren jeweiligen Zellmodellen c-Src-Kinasen für die Phosphorylierung von Caveolin-1 verantwortlich sind. Die Phosphorylierung erfolgt innerhalb von CMD, wo Caveolin pY14 danach mit Signalmolekülen wechselwirken kann. Um eine rasche Dephosphorylierung durch Tyrosinphosphatasen (CASELLI et al., 2001; LEE et al., 2006) zu verhindern, war eine Behandlung der Zellen mit Natrium-Orthovanadat essentiell.
Innerhalb der Zelle wurden c-Src-Kinasen bereits innerhalb von CMD nachgewiesen (LEE et al., 2005). Die Zugabe von PP2, einem effektiven Src-Kinase-Inhibitor, führte auch in Schweine-OL zu einer Hemmung der Caveolin pY14 unter NGF. Das zeigt die Zelltyp unabhängige Bedeutung von c-Src-Kinase für die Caveolin pY14.
Abb. 66: NGF-induzierte Caveolin pY14. Bereits nach 10-minütiger NGF Stimulation tritt in OL eine verstärkte Caveolin pY14 via c-Src-Kinase auf. Im weiteren Verlauf der Signalgebung könnte die Caveolin pY14 als Andockstelle für modulare Bindedomänen wie SH2 (Src Homologieregion 2)- und PTB-Domänen (Phosphotyrosin Bindungsdomänen) von Signalproteinen dienen (modifiziert nach FIELDING “Lipid Rafts and Caveolae“).
Phosphoryliertes Caveolin könnte als Andockstelle für modulare Bindedomänen wie SH2 (Src Homologieregion 2)- und PTB-Domänen (Phosphotyrosin Bindungsdomänen) von Signalproteinen dienen (SARGIACOMO et al., 1995; LI et al., 1996a).
In diesem Zusammenhang entdeckte Lee eine erhöhte Bindungsaffinität von Grb7 (growth factor receptor-binding protein 7), einem SH2-Domänen Adapterprotein, zu Caveolin pY14 (LEE et al., 2005). Dieses ist wiederum mit zahlreichen anderen Signalproteinen assoziiert und somit ein Baustein in der Signaltransduktion.
Letztendlich kann jedoch über die genaue Funktion, die die Caveolin pY14 bei der Signalgebung ausübt, nur spekuliert werden, da es außer einigen Anhaltspunkten noch zu wenige Studien darüber gibt.
4.4.2.1 Zusammenhang zwischen der Phosphorylierung von TrkA und der Caveolin pY14
Die Stimulation von Schweine-OL mit NGF führt zur Phosphorylierung von TrkA, einem Initialschritt in der NGF-Signaltransduktion, bei der phosphoryliertes TrkA (P-TrkA) als Andockstelle für Adapter- und Signalmoleküle dient. Eine Doppelanfärbung der Caveolin pY14 und Phosphorylierung von TrkA sollte darüber Aufschluss geben, ob die Caveolin pY14 sich unmittelbar an die c-Src-Aktivierung anschließt oder ob sie erst nach einiger Verzögerung in Folge weiterer Signalkaskaden zustande kommt. Eine eventuelle Kreuzreaktion der sekundären Antikörper und die damit verbundene Artefaktbildung wurden durch eine Kontrollfärbung ausgeschlossen. Die Doppelfärbung ergab, dass beide Phosphorylierungen in Schweine-OL NGF-induziert sind und im engen zeitlichen Zusammenhang stehen. Sie sind aller Voraussicht nach Bestandteil bei der NGF/TrkA-Signalgebung. Die Autophosphorylierung von TrkA konnte durch das Stausporin-Derivat K252a blockiert werden, was zu einer Inhibition der Fortsatzbildung führte (ALTHAUS et al., 1997a). K252a hemmt zwar auch andere Kinasen, ist aber in der eingesetzten Konzentration von 1 µM spezifisch für TrkA (TAPLEY et al., 1992). Interessanterweise führte die Gabe von K252a auch zu einer Hemmung der Caveolin pY14, was auf eine Abhängigkeit von der TrkA Phosphorylierung hindeutet.