Detektion von Caveolin in adulten Schweine-OL

Mit der Expression von Caveolin im Gehirn bzw. in neuralen Zellen hat sich bis zu Beginn dieser Arbeit nur eine relativ kleine Anzahl von Veröffentlichungen beschäftigt (GALBIATI et al., 1998; BILDERBACK et al., 1999; HUANG et al., 1999; PEIRO et al., 2000). Dabei wurde Caveolin im Kortex, Cerebellum und in Neuronen, Astrozyten sowie in PC12-Zellen, einer Tumorzelllinie der Nebenniere, detektiert (CAMERON et al., 1997; GALBIATTI et al., 1998). Erstmalig konnte in dieser Arbeit die Expression von Caveolin in adulten Schweine-OL mit einer immunzytochemischen Zellanfärbung und mittels Western Blot dokumentiert werden. Bei einer Subfraktionierung des OL-Myelins ließ sich Caveolin zudem innerhalb von Myelinfraktionen nachweisen, überraschenderweise am stärksten in der Pelletfraktion, die sich aus den parainodalen Loops rekrutieren könnte. Von den bei Caveolin bekannten Subtypen und Isoformen (SCHERER et al., 1995; LI et al., 1996c) konnte im Gegensatz zu PC12-Zellen und Astrozyten, die neben Caveolin-1 auch Caveolin-2 enthalten (GALBIATI et al., 1998), in Schweine-OL lediglich Caveolin-1 detektiert werden. Schweine-OL bilden von Caveolin-1 beide Isoformen α und β aus; diese werden von zwei verschiedenen mRNAs translatiert (KOGO et al., 2000, 2004). Der Anteil von Caveolin-1α überwog dabei in Schweine-OL deutlich. Es ist jedoch noch nicht genau geklärt, inwieweit sich diese beiden Isoformen funktionell unterscheiden. Beim Untersuchen der unterschiedlichen CMD-Erscheinungsformen entdeckte Fujimoto mithilfe von Transmissionselektronen-mikroskopie (TEM), dass in humanen Fibroblasten das Verhältnis der beiden Caveolin-1 Isoformen zueinander in Abhängigkeit vom äußeren Erscheinungsbild der CMD variieren kann. Invaginierte Caveolae, die eine Sonderform von CMD darstellen, enthalten mehr von der Caveolin-1α Isoform; wogegen in abgeflachten CMD beide Isoformen enthalten sind (FUJIMOTO et al., 2000; STAN 2005). Allerdings lassen sich aus dieser Beobachtung keine generellen Rückschlüsse für Schweine-OL ziehen, bei denen die abgeflachte CMD-Erscheinungsform überwiegend vorkommt, da die äußere Erscheinungsform von CMD von weiteren Faktoren abhängt.

4.1.1 Morphologische Erscheinungsformen von CMD

Ursprünglich wurden Caveolae, die eine Spezialform von Lipid Rafts sind, aufgrund ihres Aussehens als “schmale, nicht Clathrin-ummantelte Plasmamembran-einstülpungen“ beschrieben (PALADE 1953; YAMADA 1955). Anderson und seine Mitarbeiter waren die ersten, die herausfanden, dass caveolinhaltige Membranabschnitte, in dieser Arbeit als CMD benannt, nicht zwangsläufig eingestülpt sein müssen (ROTHBERG et al., 1990; CHANG et al., 1992), da solche Abschnitte dynamische Mikrodomänen sind, die ihr Aussehen permanent ändern und somit polymorph sind. Einige dieser morphologischen Erscheinungsformen von CMD wurden in primärkultivierten Schweine-OL elektronenmikroskopisch dokumentiert. Von den bekannten Erscheinungsformen (MATVEEV et al., 2001; STAN, 2005) konnten in dieser Arbeit alle Formen, von der Flaschenhals- oder Kolbenform bis zu den geschlossenen Formen (closed, detached), detektiert werden; ihre Größe lag bei 70-80 nm. Flache CMD hätten sich nur immunelektronenmikroskopisch darstellen lassen, was aber hier auf technische Schwierigkeiten stieß. Von ihrem Vorkommen wird aber aufgrund der mittels konfokaler Lasermikroskopie gezeigten hohen Caveolin-1-Expression in der Plasmamembran Gradienten-isolierter CMD ausgegangen. Im TEM lassen sich zwar an der Plasmamembran klassische, kolbenförmige invaginierte Caveolae darstellen, deren Verteilungsmuster würde aber zu einer punktförmigen Darstellung von Caveolin und nicht zu einer homogenen Expression von Caveolin in der Plasmamembran führen. Von daher ist anzunehmen, dass ein großer Teil des Caveolins der Plasmamembran in caveolinhaltigen Mikrodomänen (CMD), d.h. nicht-invaginiert oder kolbenförmig geformt, lokalisiert ist, weshalb in dieser Arbeit Caveolae sozusagen als Sonderform von CMD betrachtet werden. Der andere Teil des exprimierten Caveolins befindet sich dagegen außerhalb von Mikrodomänen. Über die Funktion des frei vorliegenden Caveolins ist bis heute noch nichts bekannt; es könnte eventuell als Vorrat zur Wiederauffüllung endozytierter CMD dienen.

Abb. 64: Darstellung der polymorphen Erscheinungsformen von Caveolae. Da es sich bei Caveolae um dynamische Mikrodomänen handelt, ändert sich ihre Morphologie permanent. Ihr Aussehen kann daher von der Kolbenform abweichen und zudem eine flache, geschlossene, röhren- oder traubenförmige Gestalt annehmen (MATVEEV et al., 2001).

Bei der Frage, welche der in Abb. 64 dargestellten Erscheinungsformen eine caveolinhaltige Mikrodömäne annimmt, könnten folgende Parameter von Bedeutung sein, auf die nachfolgend näher eingegangen wird:

1) Expression der verschieden Caveolin-Subtypen 2) Caveolin pY14

3) Cholesteringehalt der Zellen 4) Zelltyp-bedingte Abhängigkeit

Einige Arbeitsgruppen schreiben dem CMD-Gerüstprotein Caveolin eine entscheidende Funktion zu, von der die Struktur der CMD abhängt (SMART et al., 1996). Eine Coexpression der beiden Caveolin-Subtypen 1 und 2 führt zur Ausbildung von Caveolin-heterooligomeren Komplexen, die in verstärktem Maße zur Bildung der

klassisch-kolbenförmigen Caveolae beitragen (FUJIMOTO et al., 2000). Die Phosphorylierung von Caveolin-2 an den Serinresten 23 und 36 reguliert nach Sowa die Caveolin-1-abhängige Ausbildung des kolbenförmigen “Caveolar-Coats“ (SOWA et al., 2003). Dies könnte ein möglicher Grund dafür sein, dass Schweine-OL, die kein oder eine nicht nachweisbare Menge an Caveolin-2 besitzen, mehr abgeflachte CMD ausbilden als kolbenförmige Caveolae.

Zudem scheint eine Phosphorylierung von Caveolin-1 an Tyr. 14 zu einem Abflachen der CMD zu führen (NOMURA et al., 1999). Dies könnte durch eine zunehmende Verlagerung von Cholesterin aus den CMD heraus, die im Zuge der Caveolin pY14 auftritt, begründet sein (FIELDING 2006). Demnach ist das Zusammenspiel von Caveolin-1 und Cholesterin ein weiterer Faktor, der für die Erscheinungsform von CMD verantwortlich ist. Eine hohe Caveolin-Expression ermöglicht beispielsweise eine Cholesterin-Akkumulation und kann in diesem Fall die Ausbildung der klassischen kolbenförmigen Caveolae begünstigen (SMART et al., 1994; MATVEEV et al., 2000).

Die Relevanz des Cholesterins, das eine wichtige Komponente von CMD ist und somit bei der Genese von CMD eine Rolle spielt (ROTHBERG et al., 1990; CHANG et al., 1992), wird anhand von Versuchen, bei denen ein Cholesterinmangel ausgelöst wird, deutlich. Eine Wegnahme des zellulären Cholesterins durch Reagentien wie Nystatin, Filipin oder Methyl-ß-Cyclodextrin führt zu einer Beeinträchtigung der Caveolar-Struktur und damit zu einem verstärkten Abflachen oder Verlust von CMD (MATVEEV et al., 2000; WESTERMANN et al., 2005). Außerdem ist die Ausprägung der Caveolar-Morphologie vom Zelltyp, d.h. von weiteren Faktoren abhängig, da einzelne Zelltypen häufig charakteristische Erscheinungsformen besitzen. Zum Beispiel findet man die T-tubuläre-Form verstärkt in Muskelzellen (PARTON et al., 1997), die Caveolin-3 enthalten. Dagegen bilden Endothelzellen röhrenähnliche Caveolar-Strukturen (UEHARA et al., 1999; VASILE et al., 1999) und Adipozyten den trauben-ähnlichen Typus aus (SCHERER et al., 1994; KANDROR et al., 1995). Aufgrund der Diversität an Erscheinungsformen und Vesikeltypen dient neben der Größe auch die Ummantelung der Vesikel als wichtiges Identifikationsmerkmal. Caveolae besitzen eine relativ dünne “gestreifte“ Vesikel-Ummantelung, mit deren Hilfe man sie von der Clathrin-ummantelten Vesikel-Form unterscheiden kann. Diese “Clathrin coated pits“

kommen ebenfalls in Schweine-OL vor.