Regulation der Gefäßkontraktion und Gefäßrelaxation der glatten

Glatte Muskulatur befindet sich in vielen Hohlorganen und in den Blutgefäßen. Im Unterschied zur quergestreiften Muskulatur hat die glatte Muskulatur die Funktion einer Dauerkontraktion. Die Dauerkontraktion ist für die Peristaltik im Magen- und Darmtrakt verantwortlich, außerdem sorgt sie durch die Kontraktion von Gefäßmuskelzellen für die Aufrechterhaltung des Blutdrucks. Die Regulation der Gefäßkontraktion und -relaxation ist ein wichtiger Bestandteil der Blutdruckregulation und schafft die Möglichkeit das Kreislaufsystem dynamisch an unterschiedliche Belastungen anzupassen. Die glatte Muskulatur wird durch das vegetative Nervensystem innerviert. Die Tonusregulation geschieht über unterschiedliche Depolarisierungsgrade, Neurotransmitter oder Hormone²².

Gefäßaufbau

Arterien besten histologisch aus einer dreischichtigen Wand. Die Tunica intima als innen liegende Schicht beinhaltet das Endothel und subendotheliale Schichten. Die Tunica media umfasst die glatte Muskulatur mit den weiter unten beschriebenen glatten Gefäßmuskelzellen und zusätzlicher Extrazellulärmatrix. Als dritte und außen liegende Schicht setzt sich die Tunica adventitia aus Bindegewebe zusammen²³.

Kontraktion der glatten Gefäßmuskulatur

Ultrastrukturell sind glatte Muskelzellen wie folgt aufgebaut: Die Myofilamente, welche den Mechanismus der Kontraktion bilden, bestehen aus Actin und Myosin. Myosin beschreibt eine Gruppe von Motorproteinen, die aus einer schweren sowie unterschiedlich vielen leichten Ketten besteht. Actin ist ein Strukturprotein, welches in eukaryotischen Zellen sogenannte Actinfilamente bildet und so zum Zytoskelett-Aufbau beiträgt. Neben den kontraktilen Actin- und Myosinfilamenten besteht ein drittes Filamentsystem. Diese intermediären Filamente sind über Dens Bodies (dichte

Körperchen) zu einem elastischen Zytoskelettnetzwerk verbunden. Smoothelin, welches erstmals 1996 als spezifisches Markerprotein für glatte Gefäßmuskelzellen entdeckt wurde, ist Teil dieses filamentären zytoskelettalen Netzwerkes. Es gilt als spezifischstes Markerprotein für differenzierte glatte Gefäßmuskelzellen (SMC)²⁴. An den Dens Bodies sind auch die Actinfilamente, welche weiter an vielen Stellen der Zellmembran befestigt sind, angeheftet und bilden so zusammen mit den Myosinfilamenten das Grundgerüst der glatten Muskelzelle²².

Die ablaufenden Prozesse der Gefäßkontraktion in der glatten Muskelzelle sind bis heute nicht hinreichend untersucht. Man geht davon aus, dass unterschiedliche auslösende Faktoren eine Vielzahl von intra- und extrazellulär gelegenen Calcium-Freisetzungsmechansimen auslösen. Grob haben Amberg et al. 2013 diese Mechanismen in 5 Kategorien eingeteilt, welche im Verlauf erklärt werden:

- Calcium Waves (Wellen) - Junctional Calcium Transients - Calcium Sparks

- Calcium Puffs

- L-typ Calcium-Kanal Sparklets

Unter Calcium Waves versteht man einen sich wellenförmig ausbreitenden Calcium-Freisetzungsmechanismus. Die Calciumfreisetzung geschieht über Inositol 1,4,5-trisphosphat (InsP3)-Rezeptoren in der Membran des sarkoplasmatischen Retikulums (SR)^25,26. Die Aufrechterhaltung der Calcium Waves geschieht durch eine Calcium-induzierte Calciumfreisetzung (CICR). In mesenterialen Mausarterien konnte eine minimale Calcium Wave-Aktivität ohne Stimulation nachgewiesen werden^27,28. Die Calcium Waves können für einen globalen Calciumanstieg in der Zelle und der daraus resultierenden Kontraktion verantwortlich sein²⁹. Weiter konnte gezeigt werden, dass das intrazelluläre Calcium einen membranständigen Chloridkanal aktiviert³⁰. Die Aktivierung führt zum Chloridausstrom, die damit verbundene Membrandepolarisation zur Aktivierung membranständiger, spannungsabhängiger L-Typ-Calciumkanäle und somit zu einem weiteren Calciumeinstrom.

Als weiteren Mechanismus versteht man unter Junctional Calcium Transient einen kurzzeitigen und durch neuronale Stimuli hervorgerufenen Calciumeinstrom^31,32. Im Gegensatz zu den Calcium Waves verbleibt dieser Calciumeinstrom lokal, da er keinen

regenerierenden Ausbreitungsmechanismus besitzt. Neuronale Aktionspotenziale fördern die Freisetzung von Adenosintriphosphat (ATP) und Norepinephrin aus den perivaskulären Nervenenden. Norepinephrin stimuliert den α1-Adrenorezeptor (Mechanismus weiter unten beschrieben) und ATP bindet an Calcium-permeable purinerge Rezeptoren der Plasmamembran, welche Junctional Calcium Transients produzieren^33-35. Zusätzlich erzeugt dies erneut eine Membrandepolarisation, welche wiederum den Calciumeinstrom via spannungsabhängiger L-Typ-Calciumkanäle fördert.

Calcium Sparks sind lokalisierte Calcium-Mikrodomänen, welche durch Calcium aus dem SR über Ryanodin-Rezeptoren spontan produziert werden³⁶. Calcium Sparks haben nur einen minimalen direkten Einfluss auf die intrazelluläre Calciummenge und die damit verbundene Kontraktion, nehmen aber auf diese mittels indirekter Mechanismen Einfluss^37,38. Calcium kann membranständige Ionenkanäle aktivieren, hier vor allem den calciumabhängigen Kaliumkanal sowie den calciumabhängigen Chloridkanal, welcher bereits weiter oben beschrieben ist. Der Kaliumausstrom sorgt für eine Hyperpolarisation der Plasmamembran und vermindert die Kontraktion. Die durch den Chlorideinstrom ausgelöste Membrandepolarisation führt zur Aktivierung der spannungsabhängigen L-Typ-Calciumkanäle und lässt somit die Kontraktion erhöhen³⁹. Calcium Puffs sind eine weitere Mikrodomäne, welche über den InsP3-Rezeptor Calcium aus dem SR freisetzt⁴⁰. Noch ist dieser Mechanismus in glatten Gefäßmuskelzellen nicht nachgewiesen, es gibt jedoch indirekte Hinweise, dass die InsP3-abhängige Calciumfreigabe physiologisch relevant ist^41,42. Calcium aktiviert Ionenkanäle der Plasmamembran wie beispielsweise den transient receptor potential melastanin 4. Mittels eines damit ausgelösten Natriumeinstroms kommt es zur Membrandepolarisation und der damit verbundenen Aktivierung spannungsabhängiger L-Typ-Calciumkanäle^41-43.

Als fünfter Mechanismus sind die Calcium Sparklets zu erwähnen. Dabei handelt es sich um unterschiedliche Calciumeinströme durch Ionenkanäle der Plasmamembran.

Als Hauptfaktor für den Calciumeinstrom wird hier exemplarisch der L-Typ Calciumkanal Sparklet erwähnt⁴⁴. Die durch Wahrscheinlichkeiten bedingte kurze Öffnung dieses Kanals führt zu einem geringen Calciumeinstrom. Kommt es jedoch zu einer verlängerten Öffnung einer oder mehrere gruppierter L-Typ-Calciumkanäle, entsteht eine hohe Aktivität dieser Kanäle^45,46. Die damit verbundene Erhöhung des

intrazellulären Calciums trägt zur globalen Calciumerhöhung und der darauffolgenden Kontraktion bei.

Dieser Kontraktionsmechanismus im glatten Muskel ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Die Grundlage der Kontraktion ist die zyklisch wiederholte Interaktion zwischen den Actin- und Myosinfilamenten. Glatte Gefäßmuskel-α-Actin (SM-α-Actin) ist eine von sechs unterschiedlichen Actin-Isoformen⁴⁷. Die Kontraktion in SMC entsteht durch die zyklische Interaktion vom SM-α-Actin und smooth muscle-myosin heavy chain (SM-MHC oder auch Myh11). SM-MHC (Myh11) ist ein zytoplasmatisches Strukturprotein, welches chemische Energie in mechanische Energie durch die Hydrolyse von ATP umwandelt⁴⁸. Ab einer Calciumkonzentration von über 10^-7 mol/l bindet Calcium verstärkt an Calmodulin. Der Calcium-Calmodulin-Komplex aktiviert nun die Myosin-leichte-Ketten-Kinase (MLCK) durch Abspaltung einer Phosphatgruppe vom ATP, welches auf die regulatorische leichte Kette des Myosinkopfes übertragen wird.

Das Anhängen des Phosphatrestes führt zur Interaktion von Myosin und Actin⁴⁹. Der einsetzende Kontraktionsmechanismus wird auch als Gleitfilamentmechanismus beschrieben. Eine Calciumkonzentration unter 10^-7 mol/l inhibiert die MLCK. Weiterhin ist zur Relaxation die Myosin-leichte-Ketten-Phosphatase (MLCP) notwendig. Die MLCP katalysiert die Abspaltung eines Phosphatrestes von der leichten Kette des Myosins.

Abbildung 1: Schematische Abbildung der Kontraktion in der glatten Muskulatur

Befindet sich die Myosin-Leichtkette (Myosin-LC) im phosphorylierten Zustand (P), sorgt sie vermittelt über den Gleitfilamentmechanismus für die Kontraktion. Zur Aktivierung ist die Myosin-leichte-Ketten-Kinase (MLCK) im aktivierten Zustand verantwortlich. Steigt die Calciumkonzentration der Zelle über 10^-7 mol/l, bindet Calcium (Ca²⁺) an Calmodulin und dieser Komplex aktiviert die MLCK. Bei sinkender Calciumkonzentration entfällt die Aktivierung und die Myosin-leichte-Ketten-Phosphatase wird aktiviert und sorgt für die Dephosphorylierung und die Inaktivierung der Myosin-LC.

Die Relaxation setzt ein, sobald Myosin dephosphoryliert wird. Dies geschieht entweder durch die Abnahme der elektrischen oder neurohumoralen Aktivität oder durch inhibierende und hyperpolarisierende Zellprozesse. Die Verringerung der Calciumkonzentration geschieht durch Transport von Calciumionen in den Extrazellularraum oder in das sarkoplasmatische Retikulum. Die Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) befördert Calcium vom Zytosol in das Lumen des SR⁵⁰. Die Rate, mit der die SERCA Calciumionen in das SR pumpt, wird unter anderem durch Phospholamban (PLB) reguliert. Phospholamban inhibiert im nicht-phosphorylierten Zustand die SERCA. Phospholamban wird entweder an Serin 16 oder Threonin 17 phosphoryliert⁵¹. Die Phosphorylierung von Phospholamban hebt die Inhibition der SERCA auf und steigert so ihre Aktivität⁵². Somit wird mehr Calcium ins sarkoplasmatische Retikulum aufgenommen, was zur Relaxierung der jeweiligen Zelle beiträgt. Die Phosphorylierung an Serin 16 läuft beta-adrenerg vermittelt über die Proteinkinase A ab⁵³. Agonisten wie beispielsweise

Noradrenalin binden an Betarezeptoren der glatten Muskulatur und lösen einen G-Protein gekoppelten Prozess aus. Die so aktivierte Adenylcylase bildet aus ATP intrazelluläres, cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP)⁵⁴. Das cAMP aktiviert die Proteinkinase A, welche die Phosphorylierung an Serin 16 vornimmt. Threonin 17 wird hauptsächlich über die Calcium/Calmodulin-abgängige Proteinkinase II (CaMKII) phosphoryliert.

Phenylephrin und Kaliumchlorid

In der hier vorliegenden Arbeit werden Phenylephrin und Kaliumchlorid als kontraktionsauslösende Reagenzien verwendet. Phenylephrin, als ein Agonist des α1 -Adrenorezeptors, vermittelt die auslösende Kontraktion G-Protein-gekoppelt. Die alpha-Untereinheit des G-Proteins aktiviert die Phospholipase C, welche wiederrum das Phosphatidlyinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) in Inositol 1,4,5-trisphosphate (InsP3) und Diacylglycerol (DAG) hydrolisiert. Das entstandene InsP3 kann an seinen zugehörigen Rezeptor des sarkoplasmatischen Retikulums binden und somit die kontraktionsauslösende Calciummenge freisetzen⁵⁵. Kaliumchlorid verändert über die hohe extrazelluläre Kaliumkonzentration und die damit verbundene erhöhte intrazelluläre Kaliumkonzentration das Ruhemembranpotenzial der Zellen. Die nun ablaufende Depolarisation der Zelle führt zur Öffnung der spannungsabhängigen Calciumkanäle⁵⁶. Das extrazellulär einströmende Calcium führt anschließend zur beschriebenen Kontraktion.

Endothelvermittelte Relaxation der glatten Gefäßmuskulatur

Das Endothel ist eine Zellschicht, die alle Gefäße des menschlichen Körpers von innen auskleidet. Mit einer Dicke von 1 µm trennt es das zirkulierende Blut von der Gefäßwand und bildet eine anatomische Grenzschicht. Lange Zeit ging man davon aus, dass das Endothel lediglich eine passive anatomische Barriere darstelle. Das Endothel übernimmt jedoch eine Vielzahl an Funktionen. So hat es bei gesunden Menschen eine nicht thrombogene Oberfläche und kann somit die Adhäsion und Aggregation von Blutzellen an der Gefäßwand verhindern, weshalb es eine entscheidende Rolle in der Thrombozytenaggregation einnimmt. Neben der Thrombogenität kontrolliert das Endothel außerdem die Gefäßpermeabilität sowie inflammatorische und immunologische Prozesse^57,58.

Die jedoch wichtigste Aufgabe des Endothels ist die Regulation des Gefäßtonus. Das Endothel nimmt mit einer Vielzahl eigens produzierter, vasotonusmodulierender Substanzen eine zentrale Rolle in der Gefäßrelaxation und -kontraktion ein ^57,58. Eine der wichtigsten vom Endothel gebildeten Substanzen ist Stickstoffmonoxid (NO), welches im Folgenden genauer beschrieben wird.

Das NO-abhängige Gefäßsystem

In den 1980er Jahren entdeckten Furgott und Zawadski, das bei einer Beschädigung des Endothels vasodilatierende Substanzen wie Acetylcholin zu einer Gefäßkontraktion führen⁵⁹. Daraus wurde geschlossen, dass das intakte Endothel Substanzen bildet, die anschließend zur Vasorelaxation führen. Zunächst wurde diese Substanz Endothel-derived relaxing factor genannt. Bei einer späteren molekularen Untersuchung stellte sich diese Substanz als NO heraus.⁶⁰

NO/cGMP vermittelte Signaltransduktion

Da NO als eines der kleinen, endogen gebildeten bioaktiven Moleküle leicht in das Blut sowie in das umliegende Gewebe diffundieren kann, aktiviert es in der glatten Gefäßmuskelzelle die lösliche Guanylylzyklase (sGC). Die sGC setzt unter Beteiligung von Magnesium das Guanosin-5-Triphosphat (GTP) zu zyklischem Guanosin-3´-5´-Monophosphat (cGMP) um. cGMP wirkt als intrazellulärer second Messenger und bindet in der glatten Muskulatur an die cGMP-abhängige Serin/Threonin-Proteinkinase 1 (cGK1)^61-64. Die cGK1 spielt eine entscheidende Rolle bei der NO-vermittelten Gefäßrelaxation über einen Abfall der intrazellulären Calciumkonzentration^65,66. Die Proteinkinase phosphoryliert Phospholamban. Das phosphorylierte Phospholamban (P-PLB) hebt die Inhibition der SERCA auf, welche nun aktiv Calciumionen in das sarkoplasmatische Retikulum pumpt und die intrazelluläre Calciumkonzentration senkt.

Abbildung 2 : Schematische Abbildung der NO-vermittelten Gefäßrelaxation

In der Endothelzelle wird aus der Aminosäure L-Arginin, vermittelt über die Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS), Stickstoffmonoxid (NO) gebildet. NO diffundiert in die umliegenden glatten Muskelzellen und bildet aus Guanosin-5-Triphosphat (GTP) und Magnesium zyklisches Guanosin-3´-5´-Monophosphat (cGMP). Durch die Bindung von cGMP an Serin/Threonin-Proteinkinase 1 (cGK1) führt dies zur Phosphorylierung (P) von Phospholamban (PLB). Die damit verbundene gestiegene Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA)-Aktivität führt zur gesunkenen Calciumkonzentration (Ca²⁺).