Isolation und Kultur muriner primärer glatter Gefäßmuskelzellen

Für die Isolation von murinen primären glatten Gefäßmuskelzellen (SMC) wurden Wildtyp-Mäuse und MK2-defiziente Mäuse im Alter von fünfzehn bis siebzehn Wochen genutzt. Je Präparation einer SMC-Kultur wurden vier bis fünf Aorten verwendet. Nach einer intraperitonealen Anästhesie mit einem Ketanest/Rompum-Gemisch mit einer Dosis von 10 µl pro Gramm Körpergewicht der Maus wurden die Tiere mittels zervikaler Dislokation getötet. Anschließend folgte die Desinfektion des Thorax mit 70-prozentigem Alkohol. Die Mäuse wurden mit zwei seitlichen Haut- und Fettschnitten eröffnet. Im nächsten Schritt wurde die Aorta beginnend hinter dem Aortenbogen bis hin zur Iliakalbifurkation frei gelegt. Die Aorta wurde mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gespült, um mögliche Blutreste zu entfernen und anschließend vorsichtig vom Binde- und Fettgewebe frei präpariert. Das saubere Gefäß wurde in sterilen PBS auf Eis gelagert. Im Anschluss wurde die Aorta im ersten Verdau-Schritt in 4 ml Verdau-Lösung gegeben und für zehn bis fünfzehn min im 37 °C warmen Wasserbad inkubiert. Zur Entfernung der Adventicia wurden die Aorten in Petrischalen mit Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) plus 1 % Antibiotika (Penicillin/Streptomycin) überführt. Die gesäuberten Aorten wurden in kleine Stücke zerkleinert. Im zweiten Verdau-Schritt wurden die Stücke in Eppendorf-Gefäße mit 1 bis 1,5 ml Verdau-Lösung gelegt. Anschließend wurden die Gefäßteile für 60 min bei einer Temperatur von 37 °C auf einem Schüttler (~ 700 rpm) inkubiert. Zur Extraktion der glatten Gefäßmuskelzellen wurden zunächst 3 ml DMEM/ 20-%-fetales Kälberserum (FCS)+Antibiotika durch ein steriles Zellsieb gegeben. Anschließend wurde die Verdau-Lösung durch das Sieb filtriert. Im Anschluss wurde das Sieb erneut mit 4 ml DMEM/

20-%-FCS+Antibiotika geflutet. Durch das vorhandene FCS wurde die Verdaureaktion

Überstand wurde abgenommen und das Pellet in 3 ml DMEM/ 20-%-FCS+Antibiotika resuspendiert.

Zellkultur

Die Zelllösung wurde in 10 ml auf 37 °C vorgewärmten Wachstumsmedium in T-25 Zellkulturflaschen ausgesät und im Zellinkubator unter folgenden Bedingungen kultiviert: 37 °C, 95 % O2 und 5 % CO2. Die Flaschen waren mit Collagen-Typ I beschichtet. Das Wachstummedium setzte sich wie folgt zusammen:

- DMEM/F-12

- 20-%-fetales Kälberserum (FCS, hitzeinaktiviert) - 0,5 % Antibiotika (Penicillin/Streptomycin).

Der erste Mediumwechsel fand nach fünf Tagen mit zusätzlicher Subkultivierung der primären Passage (P0) durch Aufteilung der Zellen im Verhältnis 1:1 in die nächste Passage (P1) statt. Die entsprechenden Experimente wurden mit SMC der Passage zwei bis drei durchgeführt. Der Mediumwechsel erfolgte alle zwei Tage bzw. nach 70 - 80 % Konfluenz der Zellen. Es wurden Zellen für spätere Verwendung bei -80 °C eingefroren und gelagert. Für weitere Versuche wurden bei -80 °C eingefrorene Zellen kurz in einem Wasserbad (37 °C) erwärmt (< 1 min). Die erwärmten Zellen wurden Schritt für Schritt unter einer sterilen Sicherheitswerkbank mit laminarem Luftzug in die Zellkulturflaschen abpipettiert. Das Medium wurde am nächsten Morgen gewechselt, um das DMSO, in welchem die Zellen eingefroren wurden, zu entfernen.

2.4.3.1 Protein- und RNA-Isolation

Zur Protein- und Ribonukleinsäure (RNA)-Isolation wurden die Zellen auf 6-Well-Kulturplatten ausgesät.

Proteinisolation

Nachdem das jeweilige Medium vorsichtig abgesaugt wurde, wurden 60 µl Zell-Lyse-Puffer je Schale hinzugegeben. Die Zellen wurden mit Hilfe eines Zellschabers vorsichtig von der Versuchsplatte gelöst und in ein 1,5-ml-Reagenzgefäß überführt.

Dieses Lysat wurde über Nacht bei -20 °C gelagert, um die Proteinstruktur aufzubrechen. Am nächsten Tag wurde es 15 min bei 4 °C zentrifugiert (13000 rpm).

Das Sediment wurde verworfen und der Überstand wurde als Proteinlysat weiter

Quantitative Proteinanalyse

Zur Bestimmung der quantitativen Proteinmenge wurde die photometrische Bradford-Methode verwendet⁹⁶. Es wurde der Farbstoff Coomassie-Brillantblau benutzt, welcher im Komplex mit Proteinen ein Absorptionsmaximum bei 595 nm aufweist⁹⁷. Eine fehlende Komplexbildung erzeugt eine rötlich gefärbte Lösung mit einem Absorptionsmaximum bei 470 nm. Da die Proteinkonzentration in einer Lösung direkt proportional zur Höhe der Absorption des Komplexes ist, lässt sich unter Zuhilfenahme einer Standardreihe mit bovinem Serumalbumin (BSA) die Proteinkonzentration bestimmen. Die Proteinbestimmung wurde im zweifachen Ansatz durchgeführt.

RNA-Isolation

Die RNA-Isolation wurde mit Hilfe des RNeasy-Mini-Kits der Firma Qiagen nach Herstelleranleitung durchgeführt. Nachdem das Medium von 6-Schalen-Zellkulturplatten entfernt wurde, wurden pro Zellschalle 300 µl RLT-Puffer zur Lyse auf die Zellen gegeben und diese mit einem Zellschaber abgelöst.

Isolation

Das Lysat wurde im Anschluss auf die QIA-Shredder-Säule gegeben und bei 13000 rpm für 2 min zentrifugiert. Die Säule wurde verworfen, das Eluat mit 300 µl 70-prozentigem Ethanol gemischt und auf die RNeasy-Mini-Spin-Column-Säule gegeben.

Auch diese wurde 30 sek bei 13000 rpm zentrifugiert, 350 µl RW1-Lösung wurden auf die Säule gegeben und erneut 30 sek zentrifugiert. Das Eluat wurde anschließend verworfen.

DNase-Verdau

Es wurden 10 µl DNase-1-Stamm-Lösung mit 70 µl RDD Puffer gemischt. Die Lösung wurde auf die Säule gegeben und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 150 µl RW1-Lösung auf die Säule gegeben und 30 sek bei 13000 rpm zentrifugiert. Das Eluat wurde verworfen und die Säule wurde in ein neues Reagenzgefäß überführt. Es wurden wiederholt je 500 µl RPE-Lösung auf die Säule gegeben und für 30 sek bzw. für 2 min bei 13000 rpm zentrifugiert. Im Anschluss wurde die Säule erneut in ein neues Reagenzgefäß überführt und für 1 min zentrifugiert.

Eluierung

Der Säule, in einem 1,5 ml großen Reagenzgefäß befindlich, wurden 25 µl RNase-freies Wasser hinzugegeben. Durch eine anschließende Zentrifugation mit 13000 rpm für 1 min enthielt nun das Eluat die RNA. Anschließend erfolgte eine RNA-Konzentrationsmessung mit Hilfe des Nano Drop 2000 C (Thermo Scientific).

Reverse Transkriptase-Reaktion

Die RNA wurde nun mit Hilfe eines kommerziellen Kits nach Herstelleranleitung (High Capacity RNA-to-cDNA-Kit, Applied Biosystems) in komplementäre Desoxyribonukleinsäure (cDNA) umgeschrieben. Es wurden 9 µl Probe mit einer Menge von 1000 ng RNA mit 10 µl Puffer und 1 µl Reverse Transkriptase (RT) gemischt. Das Gemisch wurde anschließend 1 h bei 37 °C inkubiert, dann 5 min bei 95 °C aufgekocht und zum Schluss auf 4 °C heruntergekühlt. Die entstandene cDNA wurde im Verhältnis 1:4 mit destilliertem Wasser gemischt und bei -20 °C gelagert.

2.4.3.2 Polymerase-Kettenreaktion

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine Methode zur Vervielfältigung einzelner DNA-Abschnitte. Mit Hilfe der quantitativen Echtzeit PCR ist eine Quantifizierung der einzelnen DNA-Abschnitte möglich. Durch eine Fluoreszenzmessung erfolgt in Echtzeit die Quantifizierung der entstandenen DNA während des Zyklus.

Die quantitative Echtzeit-PCR wurde mit einem Gerät und einem Super-Mix der Firma Bio-Rad durchgeführt (Bio-Rad CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA und iQ™ SYBR® Green Super Mix; Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)). Das PCR-Programm umfasste 40 Zyklen bei einer Temperatur von 60 °C. SYBR Green ist ein Cyanid-Farbstoff, welcher doppelsträngige DNA sichtbar machen lässt.

Die verwendeten Primer für α-SMA, SM-MHC, Smoothelin, Caldesmon, Calponin, SERCA2A, PLB, GAPDH, TBP, B2M und ACTB werden in Kapitel 2.1.4 beschrieben.

Die SERCA2 hat zwei Isoformen: SERCA2a und SERCA2b. Zum größeren Anteil liegt die SERCA2b in SMCs vor. Es wurde ein Primer verwendet, der beide Isoformen detektiert. Alle Primer sind mit Hilfe der NCBI-Primer-BLAST⁹⁸ erstellt worden. Die Oligonukleotide wurden auf Dimere und Heterodimere mittels OligoAnalyzer 3.1⁹⁹ analysiert. Die Primer und die zu erwartenden PCR-Produkte wurden auf die

Ausbildung von Hairpin-Strukturen getestet und im Anschluss bei Eurofins MWG Operon LLC (Huntsville, AL, USA) bestellt¹⁰⁰. GAPDH, ACTB, B2M und TBP sind mit Hilfe des Genevestigators RefGenes (Nebion AG, Zürich; Switzerland)¹⁰¹ als potenzielle Referenzgene ausgesucht worden.

Die Expressionsstabilität für alle Referenzgene ist mit dem geNorm Algorithmus¹⁰² gemessen worden. Die unterschiedliche Expression wurde mit der 2^-ΔΔCt-Methode aus den Fluoreszenzwerten errechnet. Um die relative Änderung zu bestimmen, wurden die Werte auf das geometrische Mittel der drei stabilsten Referenzgene normalisiert. Alle Analysen wurden als dreifacher Ansatz konzipiert.

2.4.3.3 Western Blotting

Zusammensetzung der verwendeten Puffer siehe Kapitel 2.1.2 - 5 x Elektrophorese-Puffer

- Transferpuffer 1 x - Waschpuffer TBS-T

- Blockmedium Trockenmilch (5 %)

Zur quantitativen Bestimmung der Proteinexpression wurde das Verfahren des Western-Blots benutzt. Je Versuchsansatz wurden ca. 30 µg bis 100 µg Proteine mit einem reduzierenden Sample Buffer aufgekocht und anschließend auf ein vier bis zwölf prozentiges Bis-Tris-Gel (NuPAGE® SDS-PAGE Gel System, LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA) aufgetragen. Darauf wurden die Proteine mittels Elektrophorese in einer Mini-Trans-Blot-Kammer (BioRad, Hercules, Kalifornien, USA) der Größe nach getrennt (15 mA im Bereich des Sammelgels und 20 mA im Trenngel/Gel). Weiter wurden die Proteine im Transferpuffer auf eine Polyvinyliden-Difluorid (PVDF)-Membran (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Vereinigtes Königreich), die zuvor mit Methanol aktiviert wurde, transferiert. Der Transfer erfolgte entweder bei 30 V über Nacht, unter permanentem Rühren, oder 60 bis 90 min bei 100 V.

Am zweiten Tag wurde das Gel als Kontrolle mit Coomassie-Färbelösung gefärbt, nach anschließendem Waschen zur Dokumentation eingeschweißt und bei 4 °C gelagert. Die Membran wurde in TBS gewaschen und zur Ladekontrolle reversibel mit Ponceau-Lösung angefärbt. Nach erneutem dreimaligem Waschen wurde die Membran für 1 h mit einem Blockmedium geblockt, um unspezifische Bindungsstellen zu besetzen. Die

entsprechend Herstellerempfehlung) über Nacht bei 4 °C, unter leichtem Schütteln, inkubiert.

Am darauffolgenden Tag wurde die Membran nach einer kurzen Aufwärmphase bei Raumtemperatur dreimal für 30 min mit TBS-T gewaschen, um unspezifische Bindungen des Antikörpers zu eliminieren, und mit dem dazugehörigen Sekundärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach anschließendem Waschen (dreimal 10 min mit TBS-T) zur Elimination unspezifischer Bindungen des Sekundärantikörpers wurde die Membran mit Amersham Western Lightning Chemiluminescent Reagent Plus für 5 bzw. 1 min inkubiert. An die Sekundärantikörper ist die Horseradish Peroxidase (HRP) gekoppelt, um im anschließenden Blot-Verfahren die Proteine sichtbar machen zu können. Die entstehende Lumineszenz wurde nach Absaugen der Detektionsreagenz auf unterschiedlich lang aufgelegten Filmen dargestellt. Die Auflegezeit der Filme ist abhängig von der Signalstärke und lag bei 30 sek bis 1 h.

Zur weiteren Verwendung der Membran wurde diese dreimal in TBST gewaschen und in TBS bis zum Reblot (erneute Darstellung eines Proteins) gelagert. Vor einer erneuten Antikörperinkubation wurde die Membran erneut für 1 h im Blockmedium geblockt. Die weiteren Schritte erfolgten wie bereits beschrieben. Nach Beendigung des Versuchs wurde die Membran erneut mit Ponceau-Färbung angefärbt, über Nacht getrocknet und zur weiteren Verwendung bzw. Dokumentation im eingeschweißten Zustand aufgehoben.

Als Beladungskontrolle wurde am Ende an den identischen Blots die Expression der in der Regel stabil exprimierten Zellproteine α Actin, α Tubulin oder Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) mit entsprechenden spezifischen Antikörpern bestimmt. Als alternatives Verfahren wurden Stainfree-Gele der Firma Bio-Rad verwendet.

Zur Auswertung wurden die einzelnen Blots mit Hilfe eines Scanners digitalisiert und mit der Software ImageJ 1.44p Microsoft R Office Excel TM2007 analysiert. Um eine unterschiedliche Beladung der Gelelektrophoresetaschen auszugleichen, wurden die detektierten Signalstärken im Bezug zur Beladungskontrolle (s.o.) standardisiert. Die entsprechende Beladungskontrolle ist in den unterschiedlichen Densitometrien angeben.

Abbildung 5: Antikörpervermittelte Proteindetektion mittels Chemilumineszenzreaktion

Nachdem die Proteine im Western-Blot auf die Membran transferiert waren, wurden diese zunächst mit dem Primärantikörper (1°AK) und in einem weiteren Schritt mit dem Sekundärantikörper (2°AK) inkubiert.

An diese ist die Horseradish Peroxidase (HRP) gekoppelt. Hierdurch kann eine Lumineszenz optisch gemessen werden.

2.4.3.4 Immunfluoreszenzfärbung von glatten Gefäßmuskelzellen (SMC)

Die glatten Gefäßmuskelzellen wurden auf Shamber Slides mit je 5000 Zellen pro Zellkulturkammer ausgesät. Das Wachstumsmedium wurde anschließend abgesaugt, 200 µl Fixierlösung wurden hinzugegeben und bei Raumtemperatur für 20 bis 30 min inkubiert. Nach anschließendem dreimaligem Waschen mit PBS wurde die Platte 1 h bei Raumtemperatur mit 200 µl Block-Lösung inkubiert.

Die Primärantikörper wurden in der Verdünnung 1:2000 über Nacht bei 4 °C hinzugegeben. Der Antikörper gegen α-SMA (C6198, Sigma-Aldrich Co. LLC, St. Louis, MO, USA) war direkt an Cy3 gekoppelt. Der Antikörper gegen SM-MHC (MC-352, Kamiya Biomedical Company, Seattle, WA, USA) wurde am zweiten Tag mit dem sekundären Antikörper, welcher mit dem Farbstoff Alexafluor488 fluoreszenzgekoppelt ist, sichtbar gemacht (LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA). Die Nukleusfärbung erfolgte mit 4′,6-Diamidin-2-phenylindol (Immunoselect Antifading Mounting Medium DAPI, Dianova GmbH, Hamburg, Germany). DAPI bindet an die A-T-Regionen der DNA und lässt somit die Nuklei erkennen. Die Negativkontrollen wurden durchgeführt, indem der primäre Antikörper durch einen Kontrollantikörper, der auf die Spezies- und

Isotypen abgestimmt war, ersetzt wurde (Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA).

Die Zellen wurden anschließend mit einem Immunfluoreszenzmikroskop (Eclipse TE2000-S, Nikon Instruments Europe B.V., Amstelveen, The Netherlands) analysiert, welches mit unterschiedlichen Filtern ausgestattet ist. Als weitere Bildsoftware wurde verwendet: NIS Elements AR 4.20.01, Nikon Instruments Europe B.V., Amstelveen, The Netherlands.

2.4.3.5 Calciumsignal-Messungen

Die folgenden Calcium-Signalmessungen in glatten Gefäßmuskelzellen wurden in Kooperation mit der Universitätsklinik Gießen, Medizinische Klinik I, Abteilung für Kardiologie und Angiologie in den dortigen Laboratorien durchgeführt.

Die Versuche wurden nach einem initial etablierten und dann für SMC modifizierten Protokoll durchgeführt¹⁰³. Die intrazelluläre Calciumkonzentration der untersuchten Zellen wurde unter dem Fluoreszenzmikroskop gemessen. Mittels UV-Licht wurde der Fluoreszenzfarbstoff angeregt. Mit Hilfe eines Monochromators wurde zunächst die entsprechende Wellenlänge des verwendeten UV-Lichtes detektiert. Der Lichtstrahl wurde über einen Dichroid-Spiegel auf den Objektträger gelenkt. Das daraus emittierte Licht gelangte erneut über den Dichroid-Spiegel und eine CCD-Kamera zum aufnehmenden Computer. Das Computersystem digitalisierte das Signal und wertete es aus, wozu das entsprechende Softwareprogramm (TillVision©) verwendet wurde¹⁰³. Messung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration

Zur Messung der intrazellulären Calcium-Konzentration wurden die Zellen zunächst bei 37 °C mit Fura-2-AM (5µM) im CCT-Medium für 30 Minuten beladen. Im Anschluss erfolgte nach einem Waschen der SMCs eine Inkubation für 15 Minuten bei 37 °C mit CCT-Medium. Der verwendete fluoreszierende Calcium-Indikator Fura-2-AM besteht aus einem Fluorophor und aus einem Chelatbildner¹⁰⁴. Als Acetomethylester gelangt dieser in die Zellen, wo er von intrazellulären Esterasen gespalten wird. Nach der Spaltung ist der Calcium-Indikator als geladenes Molekül nicht mehr dazu befähigt die Zellmembran der SMCs zu durchqueren, weshalb er die Zelle nicht mehr verlassen kann. Mit den Wellenlängen 340 nm und 380 nm erfolgte eine Anregung von Fura-2-AM sechsmal pro Sekunde. Das Emissionsmaximum lag bei einer Wellenlänge von 510 nm.

Zur Auswertung der Messungen wurde der Quotient der Emmissionsintensität mit 340 nm und 380 nm Anregung gebildet (340 nm/380 nm)¹⁰³.

Das Protokoll der Kalibration Experimente sah wie folgt aus:

- Perfusion für 5 min mit Standardmedium (pH 7,2 ;1,2 mMol; Calcium 5 mM Glucose) - Perfusion für 5 min mit calcium-freiem Medium

- Perfusion für 15 min mit Kalibrations-Puffer 1(NaCl 10, KCl 125, MgSO4 1, Hepes 25, KCN 1, EGTA 5, (mM/L), Ionomycin 5µM/L), bis das Calcium maximal abfällt (R min-Werte)

- Perfusion mit Kalibrations-Puffer 2 (NaCl 10, KCl 125, MgSO4 1, Hepes 25, KCN 1, Ca²⁺ 2(mM/L), Ionomycin 5 µM/L), bis das Calcium maximal ansteigt (R max.-Werte) Die Berechnung der basalen Calcium-Konzentration erfolgte nach der Grynkiewicz-Formel¹⁰⁴: [Ca2+

]i= Kd x b x (R - Rmin) / (Rmax. - R).

R: Fura-2 Ratio (340 nm/380 nm) Rmax: Maximum Rate

Rmin: Minimum Rate

b: Rate von Rmin und Rmax bei 380 nm

Kd: Bindungsaffinität von Fura-2 für freies Calcium. Dieser Wert ist pH-abhängig.