Die MAP-Kinase aktivierte Proteinkinase 2 (MK2): wichtiger Regulator der vaskulären Kontraktion

der Medizinischen Hochschule Hannover

Die MAP-Kinase aktivierte Proteinkinase 2 (MK2) – wichtiger Regulator der vaskulären Kontraktion

DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin

in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von

Anna Höckelmann aus Paderborn Hannover 2019

am 15.01.2021

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Michael P. Manns Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Udo Bavendiek

1. Referent: Prof. Dr. Dr. med Thomas Thum, PhD 2. Referent: Prof. Dr. med. Florian Limbourg

Tag der mündlichen Prüfung: 15.01.2021 Prüfungsausschuss

Vorsitz: Prof.Dr.med. Constantin von Kaisenberg 1. Prüferin: Prof.‘in Dr. med. Anette Melk

2. Prüfer: Prof.Dr.med. Hossein Tezval

I.Inhaltsverzeichnis

I.Inhaltsverzeichnis ... I II. Abkürzungsverzeichnis ... IV III. Abbildungsverzeichnis ... VIII

1 Einleitung ... 1

1.1 Hintergrund der Untersuchung ... 1

1.1.1 Regulation der Gefäßkontraktion und Gefäßrelaxation der glatten Gefäßmuskulatur ... 2

1.1.2 MAPK-Signalweg ... 9

1.1.3 Bisher bekannte Bedeutungen der MK2 für die vaskuläre Funktion und vaskuläre Funktionsstörung ... 12

1.2 Zielstellung der Untersuchungen ... 13

1.3 Fragestellungen ... 13

2 Material und Methoden ... 14

2.1 Material ... 14

2.1.1 Reagenzien, Detergenzien und Stimulanzien ... 14

2.1.2 Puffer und Lösungen ... 15

2.1.3 Antikörper ... 18

2.1.4 Primer ... 19

2.1.5 Verbrauchsmaterialien ... 20

2.2 Geräte ... 21

2.3 Software ... 23

2.4 Methoden ... 24

2.4.1 Mauszucht ... 24

2.4.2 Gefäßrelaxationsversuche mit murinen Aortenringen ... 24

2.4.3 Isolation und Kultur muriner primärer glatter Gefäßmuskelzellen ... 27

2.4.4 Elektronenmikroskopische Bilder ... 35

2.4.5 Statistik ... 36 3 Ergebnisse ... 37 3.1 Die MK2 besitzt eine funktionelle Bedeutung für die Gefäßkontraktion ... 37 3.1.1 Verminderte Kalium-induzierte Gefäßkontraktion in MK2-defizienten Aortenringen ... 38 3.1.2 Verminderte PE-induzierte Gefäßkontraktion von MK2-defizienten Aortenringen ... 39 3.1.3 Verminderte Gefäßkontraktion in MK2-defizienten Aortenringen ist nicht durch eine basal erhöhte Aktivierung der endothelialen NO-Synthase vermittelt .... 42 3.1.4 Die durch PE-, aber nicht durch KCl-induzierte Gefäßkontraktion wird durch pharmakologische Inhibition der p38-MAPK und MK2 deutlich vermindert ... 43 3.2 Strukturelle Analyse ... 46 3.2.1 Ultrastrukturanalysen zeigen keinen Unterschied in Aortenschnitten von WT und MK2-defizienten Aortenringen ... 47 3.2.2 MK2-defiziente SMCs zeigen morphologische Unterschiede in der zellulären Immunfluoreszenz-Analyse... 48 3.3 Expression zytoskelettaler Proteine in SMCs durch MK2 reguliert ... 49 3.4 Untersuchung der SR-abhängigen Gefäßkontraktion ... 52 3.4.1 Pharmakologische Hemmung der SERCA vermindert die PE-, aber nicht die KCl-induzierte Gefäßkontraktion ... 52 3.4.2 Gefäßkontraktion durch Koffein-induzierten SR-Ca²⁺-Release ist durch MK2-Defizienz nicht beeinflusst ... 54 3.5 Proteinexpression von PLB, aber nicht die der SERCA ist signifikant vermindert in MK2-defizienten glatten Gefäßmuskelzellen ... 56 3.6 Zytosolische Calciumkonzentration vermindert in MK2-defizienten SMCs ... 58 3.7 PE-induzierte Gefäßkontraktionsmuster in MK2-defizienten Aortenringen ähneln Beobachtungen in PLB-defizienten Mäusen ... 59 3.8 Zusammenfassung der Ergebnisse ... 60 4 Diskussion ... 61

5 Zusammenfassung... 69 Literaturverzeichnis ... VIII Anhang ... XXVIII Veröffentlichungen ... XXVIII Danksagungen ...XXIX Curriculum vitae ...XXX Erklärung ...XXXI

II. Abkürzungsverzeichnis

% Prozent

1°AK Primärantikörper

2°AK Sekundärantikörper

ACh Acetylcholin

AK Antikörper

ATP Adenosintriphosphat

BSA bovines Serumalbumin

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

C57BL/6J genetischer Hintergrund der verwendeten Mausstämme

Ca²⁺ Calcium-Kationen

ca. circa

CaCl2 Calciumchlorid

CamKII Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II

cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat

CCD Charge Coupled Device

cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure

cGK1 cGMP-abhängige Serin/Threonin-Proteinkinase 1 cGMP zyklisches Guanosin-3´-5´-Monophosphat

CICR Calcium-induzierte Calciumfreisetzung

CO2 Kohlenstoffdioxid

coll kollagene Fibrillen

CPA Cyclopiazonsäure

DAG Diacylglycerol

DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol

dest. destilliert

DNA Desoxyribonukleinsäure

DMEM/F12 Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12

DMSO Dimethylsulfoxid

DTT Dithiothreitol

DWK Dosis-Wirkungs-Kurve

E Endothelzelle

EC50 mittlere effektive Konzentration

EGTA Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraessigsäure eNOS endotheliale NO-Synthase, NOS III

ERK extrazelluläre Signal-regulierte Kinase

FCS fetales Kälberserum

FELASA Federation of European Laboratory Animal Society Association

g, g/g KG, g/kg, kg Gramm, Gramm/Gramm Körpergewicht, Gramm/Kilogramm, Kilogramm

GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase

GTP Guanosin-5-Triphosphat

h, min, sek Stunde, Minute, Sekunde

H2O Wasser

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazinyl)-Ethansulfonsäure

HRP Horseradish Peroxidase

HSP Hitzeschockprotein

HCL Salzsäure

IC50 mittlere inhibierende Konzentration IVC Individual-ventilated-cages

InsP3 Inositol 1,4,5-trisphosphate

JNK/SAPK Jun-N-terminal Kinase/Stress-activated Proteinkinase

KCl Kaliumchlorid

KCN Kaliumcyanid

KH2PO4 Kaliumphosphat

l, ml, µl Liter, Milliliter, Mikroliter L-NMMA NG-Monomethyl-L-Arginin

Log Logarithmus

LPS Lipopolysaccharid

Lu Gefäßlumen

m, cm, mm, µm, nm Meter, Zentimeter, Millimeter, Mikrometer, Nanometer

MAP Mitogen-aktiviertes Protein MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase

MAPKK MAP-Kinase-Kinase

MAPKKK MAP-Kinase-Kinase-Kinase

MAPKAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase-aktivierte Proteinkinase

Mg²⁺ Magnesium-Kationen

MgSO4 x 7H2O Magnesiumsulfat-Heptahydrat

MK2, MK3, MK5 Mitogen-aktivierte Proteinkinase-aktivierte Proteinkinase 2, 3, 5

MK2KO MK2-Knockout

MLCK Myosin-leichte-Ketten-Kinase MLCP Myosin-leichte-Ketten-Phosphatase mmol/l Millimol/Liter

mN Millinewton

mRNA messenger Ribonukleinsäure

n.s. nicht signifikant

Na Natrium

Na2HPO4 x 2H2O Natriumphosphat-Dihydrat

NaOH Natriumhydroxid

Na3VO4 Natriumorthovanadat

NaCl Natriumchlorid

NaF Natriumfluorid

NaHCO3 Natriumhydrogenkarbonat

NES nukleäres Exportsignal

NLS nukleäre Lokalisationssignal NM-MHC Nicht-Muskel-Myosin-Leichtkette

NO Stickstoffmonoxid

NOS NO Synthase

O2 Sauerstoff

OsO4 Osmium Tetraoxid

P phosphorylierter Zustand

PBS Phosphatgepufferte Salzlösung

PCR Polymerase-Kettenreaktion

PIP2 Phosphatidlyinositol-4,5-Biphosphat

PLB Phospholamban

P-PLB phoshoryliertes Phospholamban PVDF Polyvinyliden-Difluorid

RIPA Puffer Radioimmunopräzipitations Assay Puffer

RNA Ribonukleinsäure

ROS reaktive Sauerstoffspezies

rpm Umdrehungen pro Minute

RT reverse Transkriptase

SDS Natriumlaurylsulfat

SEM Standardfehler des Mittelwerts

SERCA Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase sGC lösliche Guanylylzyklase

SMC glatte Gefäßmuskelzellen

SM α-Actin/ α-SMA glatte Gefäßmuskel α-Actin/ α -glatte Gefäßmuskel Actin SM-MHC/ Myh11 smooth muscle-myosin heavy chain

SNP Natrium-Nitroprussid

s.o. siehe oben

SR sarkoplasmatisches Retikulum

TBS Tris gepufferte Salzlösung

TBST Tris gepufferte Salzlösung plus Tween-20

TEMED Tetramethylethylendiamin

TNFα Tumor Nekrose Faktor α

U, mU units, milliunits

UV Ultraviolett

Ube2j1 Ubiquitin Conjugating Enzym E2 J1

V, kV Volt, Kilovolt

vs. versus

W Wochen

WB Westernblot

WT Wildtyp, Kontrollen

III. Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Schematische Abbildung der Kontraktion in der glatten Muskulatur ... 6

Abbildung 2 : Schematische Abbildung der NO-vermittelten Gefäßrelaxation ... 9

Abbildung 3: Schematische Abbildung des MAPK-Signalwegs ... 12

Abbildung 4: Schematische Abbildung der Organbadapparatur ... 25

Abbildung 5: Antikörpervermittelte Proteindetektion mittels Chemilumineszenzreaktion ... 33

Abbildung 6: Originalregistrierung einer Kontraktionskraftmessung ... 37

Abbildung 7: Kraftentwicklung in einer Dosiswirkungskurve von Wildtyp (WT)-Tieren mit Phenylephrin ... 38

Abbildung 8: Verminderte Gefäßkontraktion der MK2-defizienten Aortenringe im Vergleich mit Wildtyp-Aortenringen ... 39

Abbildung 9: A - C, Konzentrationsabhängige Gefäßkontraktion auf Phenylephrin ... 41

Abbildung 10: Gefäßkontraktion nach Zugabe des NO-Synthase-Inhibitors L-NMMA .. 43

Abbildung 11: Einflüsse des p38-Inhibitors SB2035 auf die Gefäßkontraktion ... 45

Abbildung 12: Einflüsse des MK2-Inhibitors auf die Gefäßkontraktion ... 46

Abbildung 13: Transmissionselektronenmikroskopie von Aortenringen aus WT- und MK2KO-Mäusen auf Höhe des Zwerchfelldurchtritts ... 48

Abbildung 14: Exemplarische Immunfluoreszenzdarstellung... 49

Abbildung 15: mRNA-Expression von glatten Gefäßmuskelzellen ... 50

Abbildung 16: Westernblot und Densitometrie der Proteinexpressionsanalyse glatter Gefäßmuskelzellen ... 51

Abbildung 17: Einflüsse des SERCA-Hemmers CPA auf die Gefäßkontraktion ... 53

Abbildung 18: Originalregistrierung der Koffein-induzierten Kontraktion in drei Aortenringen ... 54

Abbildung 19: Gefäßkontraktion auf 10mM Koffein ... 55

Abbildung 20: mRNA-Expression von SERCA und PLB ... 56

Abbildung 21: Westernblot und Densitometrieanalyse von PLB und SERCA ... 57

Abbildung 22: Basale zytosolische Calciummessung in SMCs ... 58 Abbildung 23: Originalregistrierung der Spannungsmessung nach 1 µM Phenylephrin 60

1 Einleitung

1.1 Hintergrund der Untersuchung

Kardiovaskuläre Erkrankungen zählen zu den führenden Todesursachen weltweit¹. Wichtige Risikofaktoren für die kardiovaskulären Erkrankungen sind insbesondere Diabetes mellitus, Tabakkonsum, Adipositas, Hypercholesterinämie, arterielle Hypertonie aber auch eine positive Familienanamnese und das männliche Geschlecht². Aufgrund der genannten Risikofaktoren gelten kardiovaskuläre Erkrankungen als Zivilisationserkrankungen. Die Weltgesundheitsorganisation versteht unter kardiovaskulären Erkrankungen hauptsächlich die folgenden³: Koronare Herzerkrankungen, cerebrovaskuläre Erkrankungen, periphere arterielle Erkrankungen, rheumatische und angeborene Herzerkrankungen sowie tiefe Venenthrombosen und Lungenarterienembolien. Die Erkrankungen gehen somit entweder vom Gefäßsystem, dem Herzen oder einer Kombination aus beiden hervor.

Als endotheliale Dysfunktion im Allgemeinen wird ein Ungleichgewicht zwischen Gefäßrelaxation und Gefäßkontraktion verstanden⁴. In der Pathophysiologie des arteriellen Hypertonus konnte 1986 in Tiermodellen eine Beeinträchtigung der endothelvermittelten Vasorelaxation heraus gearbeitet werden⁵. Die Beeinträchtigung der endothelialen Vasorelaxation gilt als Hauptmerkmal der endothelialen Dysfunktion.

Bei Patienten mit einer essentiellen Hypertonie kann die endotheliale Dysfunktion als Marker für zukünftige kardiovaskuläre Ereignisse verwendet werden⁶. Eine endotheliale Dysfunktion mit Ungleichgewicht zwischen Gefäßrelaxation und Gefäßkontraktion konnte ebenfalls in atherosklerotischen Koronargefäßen von Menschen beobachtet werden⁷. Somit spielt die endotheliale Dysfunktion eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Atherosklerose, welche als Ausgangspunkt vieler kardiovaskulärer Erkrankungen gilt⁸. Es konnte bei Patienten mit einem erhöhten kardiovaskulärem Risikoprofil eine endotheliale Dysfunktion nachgewiesen werden, ohne bereits bestehende atherosklerotische Läsionen⁹. Mehrere Arbeiten konnten bei diesen Patienten eine erhöhte kardiovaskuläre Ereignisrate aufzeigen^10-12. Auch bei Patienten mit einer positiven Familienanamnese für frühe kardiovaskuläre Ereignisse konnte eine endotheliale Dysfunktion ohne weitere andere Risikofaktoren nachgewiesen werden¹³. Die endotheliale Dysfunktion gilt somit als unabhängiger Risikofaktor für eine erhöhte

Neben dem Nachweis der endothelialen Dysfunktion in der Pathogenese der arteriellen Hypertonie und der Atherosklerose konnten endotheliale Dysfunktionen auch bei vielen anderen kardiovaskulären Risikofaktoren nachgewiesen werden: Adipositas¹⁴, Insulinresistenz^15,16, Alter^17,18, Hypertriglycerinämie¹⁹, Rauchen²⁰ und erhöhte Low Density Lipoprotein- und reduzierte High Density Lipoprotein- Konzentrationen²¹.

1.1.1 Regulation der Gefäßkontraktion und Gefäßrelaxation der glatten Gefäßmuskulatur

Glatte Muskulatur befindet sich in vielen Hohlorganen und in den Blutgefäßen. Im Unterschied zur quergestreiften Muskulatur hat die glatte Muskulatur die Funktion einer Dauerkontraktion. Die Dauerkontraktion ist für die Peristaltik im Magen- und Darmtrakt verantwortlich, außerdem sorgt sie durch die Kontraktion von Gefäßmuskelzellen für die Aufrechterhaltung des Blutdrucks. Die Regulation der Gefäßkontraktion und -relaxation ist ein wichtiger Bestandteil der Blutdruckregulation und schafft die Möglichkeit das Kreislaufsystem dynamisch an unterschiedliche Belastungen anzupassen. Die glatte Muskulatur wird durch das vegetative Nervensystem innerviert. Die Tonusregulation geschieht über unterschiedliche Depolarisierungsgrade, Neurotransmitter oder Hormone²².

Gefäßaufbau

Arterien besten histologisch aus einer dreischichtigen Wand. Die Tunica intima als innen liegende Schicht beinhaltet das Endothel und subendotheliale Schichten. Die Tunica media umfasst die glatte Muskulatur mit den weiter unten beschriebenen glatten Gefäßmuskelzellen und zusätzlicher Extrazellulärmatrix. Als dritte und außen liegende Schicht setzt sich die Tunica adventitia aus Bindegewebe zusammen²³.

Kontraktion der glatten Gefäßmuskulatur

Ultrastrukturell sind glatte Muskelzellen wie folgt aufgebaut: Die Myofilamente, welche den Mechanismus der Kontraktion bilden, bestehen aus Actin und Myosin. Myosin beschreibt eine Gruppe von Motorproteinen, die aus einer schweren sowie unterschiedlich vielen leichten Ketten besteht. Actin ist ein Strukturprotein, welches in eukaryotischen Zellen sogenannte Actinfilamente bildet und so zum Zytoskelett-Aufbau beiträgt. Neben den kontraktilen Actin- und Myosinfilamenten besteht ein drittes Filamentsystem. Diese intermediären Filamente sind über Dens Bodies (dichte

Körperchen) zu einem elastischen Zytoskelettnetzwerk verbunden. Smoothelin, welches erstmals 1996 als spezifisches Markerprotein für glatte Gefäßmuskelzellen entdeckt wurde, ist Teil dieses filamentären zytoskelettalen Netzwerkes. Es gilt als spezifischstes Markerprotein für differenzierte glatte Gefäßmuskelzellen (SMC)²⁴. An den Dens Bodies sind auch die Actinfilamente, welche weiter an vielen Stellen der Zellmembran befestigt sind, angeheftet und bilden so zusammen mit den Myosinfilamenten das Grundgerüst der glatten Muskelzelle²².

Die ablaufenden Prozesse der Gefäßkontraktion in der glatten Muskelzelle sind bis heute nicht hinreichend untersucht. Man geht davon aus, dass unterschiedliche auslösende Faktoren eine Vielzahl von intra- und extrazellulär gelegenen Calcium- Freisetzungsmechansimen auslösen. Grob haben Amberg et al. 2013 diese Mechanismen in 5 Kategorien eingeteilt, welche im Verlauf erklärt werden:

- Calcium Waves (Wellen) - Junctional Calcium Transients - Calcium Sparks

- Calcium Puffs

- L-typ Calcium-Kanal Sparklets

Unter Calcium Waves versteht man einen sich wellenförmig ausbreitenden Calcium- Freisetzungsmechanismus. Die Calciumfreisetzung geschieht über Inositol 1,4,5- trisphosphat (InsP3)-Rezeptoren in der Membran des sarkoplasmatischen Retikulums (SR)^25,26. Die Aufrechterhaltung der Calcium Waves geschieht durch eine Calcium- induzierte Calciumfreisetzung (CICR). In mesenterialen Mausarterien konnte eine minimale Calcium Wave-Aktivität ohne Stimulation nachgewiesen werden^27,28. Die Calcium Waves können für einen globalen Calciumanstieg in der Zelle und der daraus resultierenden Kontraktion verantwortlich sein²⁹. Weiter konnte gezeigt werden, dass das intrazelluläre Calcium einen membranständigen Chloridkanal aktiviert³⁰. Die Aktivierung führt zum Chloridausstrom, die damit verbundene Membrandepolarisation zur Aktivierung membranständiger, spannungsabhängiger L-Typ-Calciumkanäle und somit zu einem weiteren Calciumeinstrom.

Als weiteren Mechanismus versteht man unter Junctional Calcium Transient einen kurzzeitigen und durch neuronale Stimuli hervorgerufenen Calciumeinstrom^31,32. Im Gegensatz zu den Calcium Waves verbleibt dieser Calciumeinstrom lokal, da er keinen

regenerierenden Ausbreitungsmechanismus besitzt. Neuronale Aktionspotenziale fördern die Freisetzung von Adenosintriphosphat (ATP) und Norepinephrin aus den perivaskulären Nervenenden. Norepinephrin stimuliert den α1-Adrenorezeptor (Mechanismus weiter unten beschrieben) und ATP bindet an Calcium-permeable purinerge Rezeptoren der Plasmamembran, welche Junctional Calcium Transients produzieren^33-35. Zusätzlich erzeugt dies erneut eine Membrandepolarisation, welche wiederum den Calciumeinstrom via spannungsabhängiger L-Typ-Calciumkanäle fördert.

Calcium Sparks sind lokalisierte Calcium-Mikrodomänen, welche durch Calcium aus dem SR über Ryanodin-Rezeptoren spontan produziert werden³⁶. Calcium Sparks haben nur einen minimalen direkten Einfluss auf die intrazelluläre Calciummenge und die damit verbundene Kontraktion, nehmen aber auf diese mittels indirekter Mechanismen Einfluss^37,38. Calcium kann membranständige Ionenkanäle aktivieren, hier vor allem den calciumabhängigen Kaliumkanal sowie den calciumabhängigen Chloridkanal, welcher bereits weiter oben beschrieben ist. Der Kaliumausstrom sorgt für eine Hyperpolarisation der Plasmamembran und vermindert die Kontraktion. Die durch den Chlorideinstrom ausgelöste Membrandepolarisation führt zur Aktivierung der spannungsabhängigen L-Typ-Calciumkanäle und lässt somit die Kontraktion erhöhen³⁹. Calcium Puffs sind eine weitere Mikrodomäne, welche über den InsP3-Rezeptor Calcium aus dem SR freisetzt⁴⁰. Noch ist dieser Mechanismus in glatten Gefäßmuskelzellen nicht nachgewiesen, es gibt jedoch indirekte Hinweise, dass die InsP3-abhängige Calciumfreigabe physiologisch relevant ist^41,42. Calcium aktiviert Ionenkanäle der Plasmamembran wie beispielsweise den transient receptor potential melastanin 4. Mittels eines damit ausgelösten Natriumeinstroms kommt es zur Membrandepolarisation und der damit verbundenen Aktivierung spannungsabhängiger L-Typ-Calciumkanäle^41-43.

Als fünfter Mechanismus sind die Calcium Sparklets zu erwähnen. Dabei handelt es sich um unterschiedliche Calciumeinströme durch Ionenkanäle der Plasmamembran.

Als Hauptfaktor für den Calciumeinstrom wird hier exemplarisch der L-Typ Calciumkanal Sparklet erwähnt⁴⁴. Die durch Wahrscheinlichkeiten bedingte kurze Öffnung dieses Kanals führt zu einem geringen Calciumeinstrom. Kommt es jedoch zu einer verlängerten Öffnung einer oder mehrere gruppierter L-Typ-Calciumkanäle, entsteht eine hohe Aktivität dieser Kanäle^45,46. Die damit verbundene Erhöhung des

intrazellulären Calciums trägt zur globalen Calciumerhöhung und der darauffolgenden Kontraktion bei.

Dieser Kontraktionsmechanismus im glatten Muskel ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Die Grundlage der Kontraktion ist die zyklisch wiederholte Interaktion zwischen den Actin- und Myosinfilamenten. Glatte Gefäßmuskel-α-Actin (SM-α-Actin) ist eine von sechs unterschiedlichen Actin-Isoformen⁴⁷. Die Kontraktion in SMC entsteht durch die zyklische Interaktion vom SM-α-Actin und smooth muscle-myosin heavy chain (SM-MHC oder auch Myh11). SM-MHC (Myh11) ist ein zytoplasmatisches Strukturprotein, welches chemische Energie in mechanische Energie durch die Hydrolyse von ATP umwandelt⁴⁸. Ab einer Calciumkonzentration von über 10^-7 mol/l bindet Calcium verstärkt an Calmodulin. Der Calcium-Calmodulin-Komplex aktiviert nun die Myosin-leichte-Ketten-Kinase (MLCK) durch Abspaltung einer Phosphatgruppe vom ATP, welches auf die regulatorische leichte Kette des Myosinkopfes übertragen wird.

Das Anhängen des Phosphatrestes führt zur Interaktion von Myosin und Actin⁴⁹. Der einsetzende Kontraktionsmechanismus wird auch als Gleitfilamentmechanismus beschrieben. Eine Calciumkonzentration unter 10^-7 mol/l inhibiert die MLCK. Weiterhin ist zur Relaxation die Myosin-leichte-Ketten-Phosphatase (MLCP) notwendig. Die MLCP katalysiert die Abspaltung eines Phosphatrestes von der leichten Kette des Myosins.

Abbildung 1: Schematische Abbildung der Kontraktion in der glatten Muskulatur

Befindet sich die Myosin-Leichtkette (Myosin-LC) im phosphorylierten Zustand (P), sorgt sie vermittelt über den Gleitfilamentmechanismus für die Kontraktion. Zur Aktivierung ist die Myosin-leichte-Ketten- Kinase (MLCK) im aktivierten Zustand verantwortlich. Steigt die Calciumkonzentration der Zelle über 10^-7 mol/l, bindet Calcium (Ca²⁺) an Calmodulin und dieser Komplex aktiviert die MLCK. Bei sinkender Calciumkonzentration entfällt die Aktivierung und die Myosin-leichte-Ketten-Phosphatase wird aktiviert und sorgt für die Dephosphorylierung und die Inaktivierung der Myosin-LC.

Die Relaxation setzt ein, sobald Myosin dephosphoryliert wird. Dies geschieht entweder durch die Abnahme der elektrischen oder neurohumoralen Aktivität oder durch inhibierende und hyperpolarisierende Zellprozesse. Die Verringerung der Calciumkonzentration geschieht durch Transport von Calciumionen in den Extrazellularraum oder in das sarkoplasmatische Retikulum. Die Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) befördert Calcium vom Zytosol in das Lumen des SR⁵⁰. Die Rate, mit der die SERCA Calciumionen in das SR pumpt, wird unter anderem durch Phospholamban (PLB) reguliert. Phospholamban inhibiert im nicht-phosphorylierten Zustand die SERCA. Phospholamban wird entweder an Serin 16 oder Threonin 17 phosphoryliert⁵¹. Die Phosphorylierung von Phospholamban hebt die Inhibition der SERCA auf und steigert so ihre Aktivität⁵². Somit wird mehr Calcium ins sarkoplasmatische Retikulum aufgenommen, was zur Relaxierung der jeweiligen Zelle beiträgt. Die Phosphorylierung an Serin 16 läuft beta- adrenerg vermittelt über die Proteinkinase A ab⁵³. Agonisten wie beispielsweise

Noradrenalin binden an Betarezeptoren der glatten Muskulatur und lösen einen G- Protein gekoppelten Prozess aus. Die so aktivierte Adenylcylase bildet aus ATP intrazelluläres, cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP)⁵⁴. Das cAMP aktiviert die Proteinkinase A, welche die Phosphorylierung an Serin 16 vornimmt. Threonin 17 wird hauptsächlich über die Calcium/Calmodulin-abgängige Proteinkinase II (CaMKII) phosphoryliert.

Phenylephrin und Kaliumchlorid

In der hier vorliegenden Arbeit werden Phenylephrin und Kaliumchlorid als kontraktionsauslösende Reagenzien verwendet. Phenylephrin, als ein Agonist des α1- Adrenorezeptors, vermittelt die auslösende Kontraktion G-Protein-gekoppelt. Die alpha- Untereinheit des G-Proteins aktiviert die Phospholipase C, welche wiederrum das Phosphatidlyinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) in Inositol 1,4,5-trisphosphate (InsP3) und Diacylglycerol (DAG) hydrolisiert. Das entstandene InsP3 kann an seinen zugehörigen Rezeptor des sarkoplasmatischen Retikulums binden und somit die kontraktionsauslösende Calciummenge freisetzen⁵⁵. Kaliumchlorid verändert über die hohe extrazelluläre Kaliumkonzentration und die damit verbundene erhöhte intrazelluläre Kaliumkonzentration das Ruhemembranpotenzial der Zellen. Die nun ablaufende Depolarisation der Zelle führt zur Öffnung der spannungsabhängigen Calciumkanäle⁵⁶. Das extrazellulär einströmende Calcium führt anschließend zur beschriebenen Kontraktion.

Endothelvermittelte Relaxation der glatten Gefäßmuskulatur

Das Endothel ist eine Zellschicht, die alle Gefäße des menschlichen Körpers von innen auskleidet. Mit einer Dicke von 1 µm trennt es das zirkulierende Blut von der Gefäßwand und bildet eine anatomische Grenzschicht. Lange Zeit ging man davon aus, dass das Endothel lediglich eine passive anatomische Barriere darstelle. Das Endothel übernimmt jedoch eine Vielzahl an Funktionen. So hat es bei gesunden Menschen eine nicht thrombogene Oberfläche und kann somit die Adhäsion und Aggregation von Blutzellen an der Gefäßwand verhindern, weshalb es eine entscheidende Rolle in der Thrombozytenaggregation einnimmt. Neben der Thrombogenität kontrolliert das Endothel außerdem die Gefäßpermeabilität sowie inflammatorische und immunologische Prozesse^57,58.

Die jedoch wichtigste Aufgabe des Endothels ist die Regulation des Gefäßtonus. Das Endothel nimmt mit einer Vielzahl eigens produzierter, vasotonusmodulierender Substanzen eine zentrale Rolle in der Gefäßrelaxation und -kontraktion ein ^57,58. Eine der wichtigsten vom Endothel gebildeten Substanzen ist Stickstoffmonoxid (NO), welches im Folgenden genauer beschrieben wird.

Das NO-abhängige Gefäßsystem

In den 1980er Jahren entdeckten Furgott und Zawadski, das bei einer Beschädigung des Endothels vasodilatierende Substanzen wie Acetylcholin zu einer Gefäßkontraktion führen⁵⁹. Daraus wurde geschlossen, dass das intakte Endothel Substanzen bildet, die anschließend zur Vasorelaxation führen. Zunächst wurde diese Substanz Endothel- derived relaxing factor genannt. Bei einer späteren molekularen Untersuchung stellte sich diese Substanz als NO heraus.⁶⁰

NO/cGMP vermittelte Signaltransduktion

Da NO als eines der kleinen, endogen gebildeten bioaktiven Moleküle leicht in das Blut sowie in das umliegende Gewebe diffundieren kann, aktiviert es in der glatten Gefäßmuskelzelle die lösliche Guanylylzyklase (sGC). Die sGC setzt unter Beteiligung von Magnesium das Guanosin-5-Triphosphat (GTP) zu zyklischem Guanosin-3´-5´- Monophosphat (cGMP) um. cGMP wirkt als intrazellulärer second Messenger und bindet in der glatten Muskulatur an die cGMP-abhängige Serin/Threonin-Proteinkinase 1 (cGK1)^61-64. Die cGK1 spielt eine entscheidende Rolle bei der NO-vermittelten Gefäßrelaxation über einen Abfall der intrazellulären Calciumkonzentration^65,66. Die Proteinkinase phosphoryliert Phospholamban. Das phosphorylierte Phospholamban (P- PLB) hebt die Inhibition der SERCA auf, welche nun aktiv Calciumionen in das sarkoplasmatische Retikulum pumpt und die intrazelluläre Calciumkonzentration senkt.

Abbildung 2 : Schematische Abbildung der NO-vermittelten Gefäßrelaxation

In der Endothelzelle wird aus der Aminosäure L-Arginin, vermittelt über die Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS), Stickstoffmonoxid (NO) gebildet. NO diffundiert in die umliegenden glatten Muskelzellen und bildet aus Guanosin-5-Triphosphat (GTP) und Magnesium zyklisches Guanosin-3´-5´-Monophosphat (cGMP). Durch die Bindung von cGMP an Serin/Threonin-Proteinkinase 1 (cGK1) führt dies zur Phosphorylierung (P) von Phospholamban (PLB). Die damit verbundene gestiegene Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA)-Aktivität führt zur gesunkenen Calciumkonzentration (Ca²⁺).

1.1.2 MAPK-Signalweg

Jede Körperzelle ist dem permanenten Einfluss extrazellulärer Stimuli ausgesetzt. Eine wichtige Aufgabe der Zellen ist es, diese Stimuli, wie z.B. mitogene Wachstumsfaktoren oder Zytokine, in adäquate intrazelluläre Antworten umzusetzen. Die Mitogen- aktivierten Proteinkinasen (MAPK) sind wichtige Teile dieser intrazellulären Signalwege, um extrazelluläre Reize und Signale in intrazelluläre Antworten zu transferieren⁶⁷. Beim MAPK-Signalweg handelt es sich um eine Signaltransduktionskaskade, in welcher beteiligte Proteinkinasen Phosphatgruppenreste an die Aminosäuren Serin, Threonin oder Tyrosin anhängen (Phosphorylierung). Durch diese Phosphorylierung wird die Enzymaktivität der Substrate und ihre Lokalisation in der Zelle reguliert⁶⁸. Die wichtigsten drei MAPK-Signalwege sind:

- der extracellular Signal-regulated Kinase 1/2 (ERK1/2)-Signalweg

- der jun-N-terminal Kinase/Stress-activated Protein Kinase (JNK/SAPK)- Signalweg

Ihre jeweilige Aktivierung erfolgt über zwei vorgeschaltete Phosphorylierungsschritte, zunächst über die MAP-Kinase-Kinase-Kinase (MAPKKK) und anschließend über die MAP-Kinase-Kinase (MAPKK). Im Folgenden werden wir uns auf den p38-MAPK- Signalweg konzentrieren.

p38-MAPK-Signalweg

1994 wurde p38 in Versuchen von Lee et al. beschrieben. Hier zeigte sich, dass p38 eine entscheidende Rolle bei der Biosynthese proinflammatorischer Zytokine spielt⁷⁰. p38α, -β, -γ und -δ gehören zu der Familie der p38-MAPK-Kinasen. Sie werden unter anderem durch zelluläre Stimuli wie oxidativen oder osmotischen Stress, UV-Strahlung, Ischämie oder Hypoxie und zahlreiche inflammatorische Zytokine aktiviert⁷¹. Neben der Aktivierung von weiteren nachgeschalteten MAP-Kinasen wie der MAP-Kinase- aktivierten Proteinkinase-2 (MK2) aktiviert die phosphorylierte p38-MAPK-Kinase zudem zelluläre Substrate und Transkriptionsfaktoren⁷².

MK2-Kinase

Stokoe et al. entdeckten 1992 eine neue Serin/Threonin-Kinase, die aus Skelettmuskelzellen von Hasen isoliert wurde. Diese Kinase wird durch MAP-Kinasen aktiviert und wurde als Mitogen-aktivierte Proteinkinase-aktivierte Proteinkinase 2 (MAPKAPK 2) oder kurz MK2 bezeichnet⁷³. Die MK2 wird ubiquitär exprimiert und wird als direktes Substrat durch die Isoformen p38α und p38β aktiviert^74,75. Die Phosphorylierung der murinen MK2 findet an Threonin 319 statt⁷⁴. Im inaktiven Zustand bilden p38α und die MK2 einen stabilen Proteinkomplex, der sich durch das nukleäre Lokalisationssignal (NLS) im Kern lokalisiert^76,77. Durch die Phosphorylierung und die damit verbundene Aktivierung wird ein C-terminal gelegenes nukleäres Exportsignal (NES) freigelegt. Durch diesen Prozess gelangt der aktivierte phospho-p38α/phospho- MK2-Komplex mittels Translokation ins Zytosol^78-80.

Wie bereits beschrieben, spielt der p38/MK2-Signalweg eine zentrale Rolle in der Regulation proinflammatorischer Prozesse. Es wurde bereits früh entdeckt, dass die MK2 essenziell für die Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte Bildung des Tumor-Nekrose- Faktors α (TNFα) ist⁸¹. TNFα ist neben den Interleukinen als intrazelluläre Botenstoffe des Immunsystems ein wichtiger Bestandteil der Immunantwort bei Entzündungsprozessen. Zusätzlich konnte bei MK2-defizienten Tieren eine verminderte

eine erhöhte Resistenz gegenüber inflammatorischen Prozessen. Neininger et al.

konnten 2002 zeigen, dass neben TNFα die MK2 ebenfalls eine Rolle bei der Produktion von Interleukin 6 spielt⁸³. Ein wichtiger Mechanismus, über den die MK2 die Expression inflammatorischer Proteine reguliert, ist eine posttranskriptionelle Stabilisierung kodierender messenger Ribonukleinsäuren (mRNA). Diese Stabilisierung wird über eine Phosphorylierung von RNA-bindenden Proteinen durch die MK2 reguliert, die in Abhängigkeit der Phosphorylierung durch die MK2 entsprechend stabilisierend oder destabilisierend auf die mRNA wirken. Die posttranskriptionelle Stabilisierung der mRNA resultiert in einer erhöhten Proteinbiosynthese der Zielproteine^83-87.

Neben dieser beschriebenen Funktion inflammatorischer Prozesse spielt die MK2 eine entscheidende Rolle in der Beeinflussung des Zellzyklus, der Zellmigration und des Actinremodelling. Die MK2 ist für die vermehrte Degradierung des Tumorsuppresorgens p53 verantwortlich und wird neben der Checkpointkinasen 1 und 2 als weitere Kontrollkinase des Zellzyklus angesehen⁸⁸. Die MK2 nimmt über die Regulation des Hitzeschockproteins (HSP) 25/27 Einfluss auf die Actinpolymerisierung und das damit verbundene Zytoskelett. Das Remodeling des Zytoskeletts ist die Voraussetzung für die Änderung der Zellgestaltung. Es konnte in glatten Gefäßmuskelzellen, neutrophilen Granulozyten und in Endothelzellen ein Einfluss des p38-MAP-Kinase/MK2/HSP- Signalwegs auf die Zellmigration nachgewiesen werden. Eine Hemmung der MK2 führt in diesen Zellen zu einer verminderten Migrationsfähigkeit^89-91. Die gerichtete Zellmigration ist sehr entscheidend für die embryonale Entwicklung. Migrationsdefekte wurden bei MK2-defizienten Tieren jedoch nicht nachgewiesen, was vermuten lässt, dass andere Proteinkinasen diese Funktion kompensatorisch übernehmen.

Abbildung 3: Schematische Abbildung des MAPK-Signalwegs

Außerhalb der Zelle gelegene Stimuli sorgen für die Aktivierung der Mitogen-aktivierte Protein (MAP)- Kinase-Kinase-Kinase (MAPKKK) und anschließend zur Aktivierung der MAP-Kinase-Kinase (MAPKK), die darauffolgende MAP-Kinase (MAPK) aktiviert durch eine Phosphorylierung (P) p38. Durch die zusätzliche Aktivierung der MK2, die im inaktiven Zustand mit der p38 einen stabilen Komplex im Zellkern bildet, gelangt dieser aktivierte phospho-p38/phospho-MK2-Komplex aus dem Zellkern und kann zur Wirkung der MK2 führen. Diese wirkt beispielsweise aktiv innerhalb des Zellzyklus, der Inflammation oder der Zellmigration.

1.1.3 Bisher bekannte Bedeutungen der MK2 für die vaskuläre Funktion und vaskuläre Funktionsstörung

Der Einfluss der MK2 auf die endotheliale Funktion ist nicht umfangreich untersucht. Es gibt allerdings Arbeiten, die zeigen konnten, dass die MK2 vasoprotektive Effekte hat.

Ebrahimian et al. entdeckten, das die Angiotensin-II-vermittelten vaskulären Antworten, wie die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und ein Blutdruckanstieg, durch die MK2 vermittelt werden. Bei MK2-defizienten Mäusen zeigten sich geringere ROS- Spiegel, bzw. ein fehlender Angiotensin-II-induzierter Blutdruckanstieg⁹². In weiteren Untersuchungen an MK2-defizienten Tieren konnte gezeigt werden, dass diese Tiere zum einen eine im Vergleich zum Kontrolltier signifikant verminderte Atherosklerosebildung aufweisen⁹³, zum anderen, dass die MK2-Defizienz die Neointima-Bildung und eine Media-Hypertrophie nach Gefäßverletzungen reduziert⁹⁴.

1.2 Zielstellung der Untersuchungen

Aufgrund der beschriebenen Beeinflussung des Blutdrucks in MK2-defizienten Mäusen, besitzt die MK2 vermutlich eine wichtige Rolle in der Regulation des vaskulären Tonus.

Im ersten Teil dieser Arbeit wird daher die Rolle der MK2 in Gefäßkontraktions- und relaxationsexperimenten an isolierten Aortenringen von Wildtyp- und MK2KO-Mäusen im Organbad analysiert. Im Anschluss folgen Untersuchungen zugrundeliegender Mechanismen, über welche die MK2 den Gefäßtonus reguliert. Dies umfasst funktionelle Untersuchungen mit spezifischen Inhibitoren in den Organbadexperimenten, die Analyse regulatorischer Proteine, der Zellstruktur sowie der intrazellulären Calcium-Homöostase.

1.3 Fragestellungen

Die nachfolgenden Fragestellungen werden in dieser Dissertation untersucht:

1. Spielt die MK2 eine funktionelle Rolle in der Regulation des Gefäßtonus?

2. Welche Mechanismen liegen einer potentiellen Regulation des Gefäßtonus durch die MK2 zugrunde?

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Reagenzien, Detergenzien und Stimulanzien

Firma Bestellnummer

3 x Blue Loading Buffer, Cell Signaling #7722

Aqua dest. Berlin Chemie AG V073935/01

Acetylcholin Sigma #A9101

Acrylamide Mix, 30%ig Roth #3029.1

Ammonium Persulfat Sigma #A3678-25 g

BioRad Protein Assay Dye Reagent BioRad #500-0006

BioRad Protein Assay Standard BioRad # 500-0005

Complete Tablets, EDTA-frei, Easy Pack

Roche 04693132001

Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth #154938-100 ml

DTT Cell Signaling #7016

EDTA Roth #8043.1

Glucose Merck 1.08342.1000

Glycin Sigma #G8898-1kg

Isopropanol Sigma #33539-1L

Kaliumchlorid (KCl) Sigma #P9541

Kaliumphosphat (KH2PO4) Sigma #P9791

Calciumchlorid (CaCl2) Roth #5239.2

L-NMMA (NG-Monomethyl-L-Arginin), NOS Inhibitor

Merck #475868-25mg

Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4 x 7H2O)

Sigma #M5921

Methanol Sigma #32213-2,5l

Milchpulver GE Heathcare UK

limited

RPN 2125 V

Natriumbikarbonat (NaHCO3) Sigma #S5761

Natriumchlorid (NaCl) Sigma #31434

Natrium-Nitroprussid (SNP) Sigma #S0501

Phenylephrin Sigma #P8155

Ponceau Solution Sigma P7170-1L

Natriumlaurylsulfat (SDS) Sigma #71736-10ml

Natrium orthovanadate (Na3VO4) Sigma #S-6508-10g

Stripping Puffer Thermo Scientific #21059

TEMED Sigma #S21844-274

Tris-HCL Roth # 9090.2

Triton-X 100 Roth #3051.2

Trizma base Sigma #6066-500g

Trizma Pre-set crystals Sigma #T9443-250g

Trizma hydrochloride solution pH 7,6 Sigma #T2444-1l Trizma hydrochloride solution pH 7,0 Sigma #T1819-1L

Tween-20 Sigma P2287-100ml

Western Lightning ECL Thermo Scientific #32132

2.1.2 Puffer und Lösungen Zellkulturmedien

Konzentration/Menge Firma Bestellnummer Wachstum-Medium

DMEM/F 12 500 ml Biochrom #FG 0415

FCS 20% PAA #A15-151 Penicillin/Streptomycin 0,5% GIBCO #15140-122 Zell-Lyse-Puffer

RIPA 10x 40 µl Cell Signaling #9806

Protease Inhibitor 10%

40 µl Roche #04693159001

Destilliertes H20 320 µl für 400 µl Zusätze/Weiteres

Trypsin 10 x Invitrogen #15400-054

Fibronectin, human BD #356008

Collagen Typ I Sigma #C3867

Collagenase Typ II 500 U/ml CLS II/Biochrom #C2-22

Elastase 0,05 U/ml Sigma #E1250

PBS (1x) 500 ml PAA #H15-002

Verdau-Lösung

Collagenase Typ II 0,04 g

Elastase 300 µl

DMEM + 1 %

Antibiotika

15 ml Siehe oben Siehe oben

RNA-Isolation

RNeasy MiniKit Qiagen #74106

Reverse Transkriptase Reaktion High Capacity RNA to

cDNA

Applied Biosystem #00288649

Einfriermedium

FCS 9 ml Life Technologies #16000-036

DMSO 1 ml Sigma-Aldrich #D2438

CCT Medium

Medium 199 9,8 g/l Gibco #31150-022

HEPES 36 g/l Calbiochem #375368

Kreatin 5 mM

Karnitin 2 mM

Taurin 5 mM

Das CCT-Medium wurde mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,4 titriert.

Westernblot

5 x Elektrophorese-Puffer

TrisBase 15,15 g/l

Glycin 72 g/l

SDS 5 g/l

ad Aqua dest. 1000 ml

Transferpuffer 10 x

TrisBase 30,3 g/l

Glycin 144 g/l

ad Aqua dest 1000 ml

Transferpuffer 1 x

Transferpuffer 10 X 100 ml/l

Methanol 200 ml/l

SDS 1 ml/ml

ad Aqua dest. 1000 ml

Waschpuffer TBS-T

NaCl 8 g/l

TrisHCl 20 ml/l

Tween 20 1 ml/l

ad Aqua dest. 1000 ml

Blockmedium Trockenmilch (5 %)

Milchpulver 2 g

TBS-T 40 ml

Organbad

Krebs-Puffer Endkonzentration

NaCl 36 g/l 123 mM

CaCl2 x2H2O 0,92 g/l 1,25 mM

KCl 1,752 g/l 4,7 mM

MgSO4x7H2O 1,478 g/l 1,2 mM

NaHCO3 6,5 g/l 15,5 mM

KH2PO4 0,816 g/l 1,2 mM

Glucose 2,28 g/l

Krebs-Puffer (60 mM K⁺) Endkonzentration

NaCl 1,98 g/l 67,7 mM

CaCl2 x2H2O 0,092 g/l 1,25 mM

KCl 2,23 g/l 60 mM

MgSO4x7H2O 0,1478 g/l 1,2 mM

NaHCO3 0,65 g/l 15,5 mM

KH2PO4 0,816 g/l 1,2 mM

Glucose 2,28 g/l

2.1.3 Antikörper

Antikörper gegen Quelle Firma Bestellnummer Verdünnung

α Tubulin Kaninchen Cell

Signaling

2125S 1:2000

α smooth muscle Actin Kaninchen Abcam 5694 1:1000

β Actin Kaninchen Cell

Signaling

4967

Caldesmon Kaninchen Sell

Signaling

12503 1:1000

Calponin Kaninchen Epitomics 1806-1 1:20000

HRP-konjugierter Antikörper, anti-Kaninchen

Ziege Cell Signaling

7074S 1:10000

HRP-konjugierter Antikörper, anti-Maus

Pferd Cell Signaling

7076 1:10000

HRP-konjugierter Antikörper, anti-Ratte

Ziege Santa Cruz

2065 1:2000

Phospholamban Maus Dianova ABR-01141 2 µg/ml

SERCA2 Maus Dianova ABR- 01138 1:1000

Smooth Muscle Myosin Heavy Chain (SM1)

Ratte Kamiya MC-352 1:1000

Smoothelin Kaninchen Santa

Cruz

28562 1:200

2.1.4 Primer α-SMA

(Acta2, NM_007392)

Forward 5’-GTC CCA GAC ATC AGG GAG TAA-3’

Reverse 5’-TCG GAT ACT TCA GCG TCA GGA-3’

SM-MHC

(Myh11, NM_001161775.1)

Forward 5’-AGA GCA AAC TCA GGA GAG GAA ACG A- 3’

Reverse 5’-TGA GTC CCG AGC GTC CAT TTC T-3’

mouse smoothelin

(Smtn, NM_001159284.1)

Forward 5’-GCG GCT CCT CCC GTC GGT CTG-3’

Reverse 5’-TGC CCC AGG GTA TTT TGC TCT CAG T- 3’

Calponin

(Cnn1,NM_009922.4)

Forward 5`- GAC GGG ATC ATT CTT TGC GAA-3`

Reverse 5`- CCC CAT ACT TGG TAA TGG CTT TG-3`

Caldesmon

(Cald1,NM_001347100.1)

Forward 5`- GCC GTT CAA GTG CTT CAC TC-3`

Reverse 5`- TGT`CAA TCT TGG AGA CTA CTG CT-3 SERCA2

(Atp2a2, NM_001110140)

Forward 5’-CTACCTGGAACAACCCGCAATAC-3' Reverse 5’-ACGCACCCGAACACCCT-3'

Phospholamban

(Plb, NM_001081407.1)

Forward 5’-GAAATGCCTCAGCAAGCAC-3' Reverse 5’-AGGTCTGGAGTGGCGG-3’

glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases

(GAPDH,NM_001289726.1)

Forward 5′-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3′

Reverse 5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3′

β-2 microglobulin Forward 5’-ATG GCT CGC TCG GTG ACC CT-3’

5’

TATA-box binding protein (TBP, NM_013684.3 )

Forward 5’-GAGCCAGGACAACTGCGTT-3’

Reverse 5’-ACAGCTCCCCACCATGTTCTGGA-3’

β-actin

(Actb, NM_007393.3)

Forward 5’-CTT TGC AGC TCC TTC GTT G-3’

Reverse 5’-CGA TGG AGG GGA ATA CAG C-3’

2.1.5 Verbrauchsmaterialien

häufig genutztes Material Größe Firma Katalog Amersham Hyperfilm ECL 18-24 cm GE Healtcare #28906837 BioRad Immun Blot PVDF

Membran

Bio Rad #162-0177

Bio Rad Criterion (TM) blotter Filterpapier

Bio Rad #1704085

Eppendorf Research^® plus, mittelgrau

0.5 – 10 µL Eppendorf #3120000020

Eppendorf Research^® plus, gelb

2 – 20 µL Eppendorf #3120000038 Eppendorf Research^®

plus, gelb

10°– 100 µL Eppendorf #3120000046

Eppendorf Research^® plus, blau

100 – 1000 µL Eppendorf #3120000062

Multipette^® M4 1 µL – 10 mL Eppendorf #4982000012 Eppendorf Easypet^® 3 5 ml-25 ml Eppendorf #4430000018

Schraubröhre 50 ml Sarstedt #6.2.547.004

Reagenzgefäß 1,5 ml Sarstedt #72.690.001

Reagenzgefäß 15 ml Sarstedt #62.554.002

Pipettenspitzen, blau bis 1000 µl Sarstedt #70.762 Pipettenspitzen, blau,

serologisch

bis 5 ml Sarstedt #86.1253.001

Pipettenspitzen, gelb bis 200 µl Sarstedt #70.760.002 Pipettenspitzen, gelb,

serologisch

bis 1 ml Sarstedt # 86.1251.001

Pipettenspitzen, orange, serologisch

bis 10 ml Sarstedt #86.1254.001

Pipettenspitzen, rot, serologisch

bis 25 ml Sarstedt #86.1685.001 Pipettenspitzen, weiß bis 10 µl Sarstedt #70.1115.210 Pipettenspitzen, gelb bis 100 µl Sarstedt #70.760.212

Versuchsplatten, 96 Well 35 mm² Sigma TPP 92096

2.2 Geräte

Typ/Modell Firma Katalog

4-Kammersystem Organbad 5 ml Föhr Med.

Instruments, Seeheim-Ober Beerbach, Deutschland

Aria Pressure Volume

Conductance System

Millar

Automatic Cell Counter TC 20 Bio Rad

C 1000 Touch Thermal Cycler Bio Rad #1851196

CCD-Kamera TILL-Photonics,

Gräfeling

Dichroid-Spiegel Olympus,

Hamburg Eletronic Cold Plate NOX-E.1-CP Noxygen

Emissionsfilter Olympus,

Hamburg

Eppendorf-Zentrifuge 5810 R Eppendorf

Inverses Mikroskop IX 50 Olympus,

Hamburg

Kühlzentrifuge Universal

320R

Hettich Zentrifugen

Leicea-Lichtmikroskop M20 Leicea, Deutschland Lichtmikroskop mit Kamera CKX31 Olympus

Mastercycler Nexus flat Eppendorf #6330000013

Messverstärker Organbad Föhr Med.

Instruments, Seeheim-Ober Beerbach, Deutschland

Microzentrifuge DW-41-230 Qualitron

Corporation Mikro-Cath™ Diagnostic Pressure

Catheter

Millar

Mini-Trans-Blot-Elektrophorese- Kammer

BioRad #170-3930

Monochromator TILL-Photonics,

Gräfeling Multi detection Microplate Reader BioTEK Nano-Drop-Spectophotometer 2000c Thermo Scientifix

Power Pac Basic Bio Rad

Reichert-Ultracut-E-Ultramikrotom Leica

Microsystems,

Leica,

Deutschland

Thermomixer compact Eppendorf

Transmissionselektronenmikroskop Morgagni 268 FEI Company, Eindhoven, NL

Vacuum Aspiration System Ditabis

Veleta 2kx2k CCD Camara Olympus Soft

Imaging Solutions, Münster, Deutschland

Vortex-Mixer Heidolph #036130000

Umlaufthermostat C1 Gebr. Haake GmbH,

Karlsruhe, Deutschland

Waage (mg) Sartorius CPA 225 D

Waage (g) Kern PLJ 3500-2NM

Wasserbad GFL #1003

Xenon-Lampe TILL-Photonics,

Gräfeling

Zellkulturbank Maxi Safe

2020

Bench Thermos

Zellkulturinkubator Sanyo

2.3 Software

Auswertung Microsoft Excel 2010

Fluoreszenzmessungen Computersoftware

TILL-Photonics, Gräfeling

GraphPad Prism 6.01 GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA

Isometrische Spannungsmessung im Organbad

FMI VitroDat Olympus Soft Imaging Solutions, Münster,

Deutschland

Olympus Soft Imaging Solutions

PCR-Aufnahme CFX Manager

2.4 Methoden 2.4.1 Mauszucht

Es wurden Wildtyp-Mäuse (C57BL/6J, WT) und MK2-defiziente Mäuse (B6.129- Mapkap2^tm1Mgl, MK2KO) verwendet⁸¹. Letztere wurden durch die Arbeitsgruppe von Professor Gaestel, Medizinische Hochschule Hannover, zur Verfügung gestellt. MK2- defiziente Mäuse besitzen den genetischen Hintergrund C57BL/6J und wurden mindestens in den zehn zurückliegenden Generationen miteinander gekreuzt.

Die Mäuse wurden tierschutzgerecht im Individual-ventilated-cages-Bereich (IVC) im Zentralen Tierlaboratorium gehalten. Die Tiere erhalten ihr Wasser und Futter ad libitum. Es bestehen kontrollierten Licht- und Temperaturverhältnissen, dort beträgt der helle Lichtzyklusanteil vierzehn Stunden. Die Organentnahmen zu wissenschaftlichen Zwecken nach Tötung der Tiere wurden nach §4 des Tierschutzgesetztes gegenüber dem Tierschutzbeauftragten der Medizinischen Hochschule Hannover angezeigt (Aktenzeichen: 2015/100).

2.4.2 Gefäßrelaxationsversuche mit murinen Aortenringen Gefäßpräparation

Es wurden WT- und MK2KO-Mäuse im Alter von dreizehn bis zweiundzwanzig Wochen verwendet. Die Mäuse wurden unter initialer 5-%-Isoflurannarkose durch zervikale Dislokation getötet und im Anschluss an den vier Extremitäten auf einer Styroporplatte befestigt. Mit zwei seitlichen Haut- und Fettschnitten wurden das Abdomen und der Thorax eröffnet. Um an die im hinteren Mediastinum gelegene Aorta thorakalis zu gelangen, wurden zunächst die inneren Organe im Abdomen entfernt (Leber, Magen, Darm, Milz). Daraufhin wurden bei besserer Sicht und unter großer Vorsicht das Zwerchfell und die Lungen entfernt. Die Aorta wurde vom Zwerchfell Richtung kranial unter Zuhilfenahme eines binokularen Mikroskops freipräpariert, wobei zunächst großzügig Binde- und Fettgewebe entfernt wurde. Nach Entfernung des Herzens wurde die Aorta nahe der abgetrennten Aortenklappe fixiert und nach distal hin zum Zwerchfelldurchtritt aus dem Situs gelöst. Anschließend erfolgte eine Perfundierung mit Krebs-Henseleit-Puffer zur Entfernung der noch vorhandenen Blutresten. Nach Entnahme der Aorta wurde diese in eine auf Eis stehende, mit Krebs-Henseleit-Puffer gefüllte Petrischale gegeben. Anschließend wurde unter mikroskopischer Sicht das restliche Binde- und Fettgewebe auf einer Eisplatte entfernt.

Nach dieser sorgfältigen Säuberung wurde mit einem Skalpell die Aorta, beginnend am Ende des Aortenbogens, in zwei bis drei Millimeter dicke Ringe geschnitten. Der restliche Teil der Aorta wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C bis zur Proteinextraktion gelagert.

Anschließend wurden die Ringe zwischen zwei Titanhaken in die 6-ml-Gefäße des Organbads überführt. Gefüllt sind die Bäder mit auf 37 °C vorgewärmten Krebs- Henseleit-Puffer unter kontinuierlicher Carbogenbegasung (95 % Sauerstoff und 5 % Kohlenstoffdioxid). Die Versuche wurden in zwei 4-Kammersytem-Organbad-Geräten der Firma Föhr Medical Instruments durchgeführt.

Abbildung 4: Schematische Abbildung der Organbadapparatur

Die aufgespannte Aorta befindet sich im gewärmten Wasserbad, welches mit Carbogen versetzt ist. Über den Ablauf kann die Flüssigkeit des Organbades getauscht werden. Die Aorten sind über einen feinen Draht an einen Kraftaufnehmer (A) angeschlossen. Mittels eines Verstärkers (B) kann das Signal am Computer (PC) bzw. einem Schreiber (C) aufgezeichnet und ausgewertet werden.

Äquilibrierung und Vorspannung der Gefäße

Nach einer 30-minütigen Äquilibrierung mit dreimaligem Mediumwechsel wurden die Gefäße schrittweise auf die für die Versuche gewählte Vorspannung (3 mN, 5 mN oder 10 mM) vorgespannt. Die Vorspannung wurde alle fünf Minuten um 0,5 mN erhöht.

Anschließend blieb diese Vorspannung unter erneuter Äquilibrierung und dreimaligem Mediumwechsel konstant und es konnte mit den Versuchen begonnen werden.

Bestimmung der Maximalkontraktion durch Kaliumchlorid (KCl)-Stimulation

Zur Bestimmung der Maximalkontraktion wurden die Aortenringe zweimal durch Zugabe von 60 mM Kaliumchlorid kontrahiert. Nach dem jeweiligen Erreichen eines Plateaus wurden die Ringe mindestens dreimal mit vorgewärmtem Krebs-Henseleit-Puffer gewaschen und für 20 bis 30 min äquilibriert.

Gefäßkontraktion durch Phenylephrin (PE)

Für die Dosis-Wirkungs-Kurve (DWK) mit Phenylephrin (PE) wurden zu den Ringen entsprechende Mengen an PE hinzugegeben, um Organbadkonzentrationen in halblogarithmischen Schritten im Bereich von 10^-9 M bis 10^-5 M zu erreichen. Nach Erreichen eines Plateaus wurde der nächst höhere Konzentrationsschritt initiiert. Um zu Beginn die Funktion des Endothels zu prüfen, wurden die Aortenringe nach Beenden der PE-DWK durch Hinzugabe von Acetylcholin (ACh) in einer Organbadkonzentration von 10^-6 M relaxiert. Anschließend wurde mindestens dreimal gewaschen, um die Substanzen aus dem Organbad und den Gefäßen zu eliminieren. Nach einer Ruhephase und dem Erreichen der Ausgangsspannung konnte mit einem weiteren Versuchsteil fortgefahren werden.

Endothelabhängige und -unabhängige Gefäßrelaxation

Nach der erstmaligen groben Funktionsüberprüfung des Endothels durch Zugabe von ACh nach Durchführung der PE-DWK wurde die endothelabhängige Gefäßrelaxation mit ACh-DWK genauer untersucht. Dazu wurden die Aortenringe durch 1 µM Phenylephrin vorkontrahiert. Die Dosis entnahmen wir der Arbeit von Ponnoth et al. aus dem Jahr 2012 ⁹⁵ und aus den eigenen PE-Dosiswirkungskurven. Nach Erreichen eines Plateaus nach PE-Vorkontraktion wurde eine DWK mit Acetylcholin in halblogarithmischen Schritten von 10^-9 M bis 10^-6 M durchgeführt.

Nach Durchführung der ACh-DWK wurde zur Bestimmung der Endothel-unabhängigen Gefäßrelaxation nach Auswaschen und erneuter Äquilibrierung eine DWK mit Natrium- Nitroprussid (SNP) in halblogarithmischen Schritten von 10^-10 M bis 10^-6 M durchgeführt.

SNP ist ein direkter NO-Donor, der eine direkte NO-vermittelte Gefäßrelaxation

Inhibitor- und Koffein-Versuche

In weiteren Versuchsabschnitten wurde der Einfluss des NO-Synthase(NOS)-Inhibitors NG-Monomethyl-L-Arginin (L-NMMA) und die Auswirkungen von Koffein in Wildtyp- Aortenringen (WT) und MK2-defizienten Aortenringen (MK2KO) untersucht. Weiter wurde in WT-Aortenringen die Wirkung der folgenden Inhibitoren auf PE im Vergleich zur jeweiligen Lösungssubstanz (Dimethylsulfoxid(DMSO)) in entsprechenden Lösungsmittelkonzentrationen (0,1 %) untersucht: p38-Inhibitor SB203580, MK2- Inhibitor PF 3644022 und SERCA-Inhibitor Cyclopiazonsäure (CPA).

2.4.3 Isolation und Kultur muriner primärer glatter Gefäßmuskelzellen

Für die Isolation von murinen primären glatten Gefäßmuskelzellen (SMC) wurden Wildtyp-Mäuse und MK2-defiziente Mäuse im Alter von fünfzehn bis siebzehn Wochen genutzt. Je Präparation einer SMC-Kultur wurden vier bis fünf Aorten verwendet. Nach einer intraperitonealen Anästhesie mit einem Ketanest/Rompum-Gemisch mit einer Dosis von 10 µl pro Gramm Körpergewicht der Maus wurden die Tiere mittels zervikaler Dislokation getötet. Anschließend folgte die Desinfektion des Thorax mit 70- prozentigem Alkohol. Die Mäuse wurden mit zwei seitlichen Haut- und Fettschnitten eröffnet. Im nächsten Schritt wurde die Aorta beginnend hinter dem Aortenbogen bis hin zur Iliakalbifurkation frei gelegt. Die Aorta wurde mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gespült, um mögliche Blutreste zu entfernen und anschließend vorsichtig vom Binde- und Fettgewebe frei präpariert. Das saubere Gefäß wurde in sterilen PBS auf Eis gelagert. Im Anschluss wurde die Aorta im ersten Verdau-Schritt in 4 ml Verdau-Lösung gegeben und für zehn bis fünfzehn min im 37 °C warmen Wasserbad inkubiert. Zur Entfernung der Adventicia wurden die Aorten in Petrischalen mit Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) plus 1 % Antibiotika (Penicillin/Streptomycin) überführt. Die gesäuberten Aorten wurden in kleine Stücke zerkleinert. Im zweiten Verdau-Schritt wurden die Stücke in Eppendorf-Gefäße mit 1 bis 1,5 ml Verdau-Lösung gelegt. Anschließend wurden die Gefäßteile für 60 min bei einer Temperatur von 37 °C auf einem Schüttler (~ 700 rpm) inkubiert. Zur Extraktion der glatten Gefäßmuskelzellen wurden zunächst 3 ml DMEM/ 20-%-fetales Kälberserum (FCS)+Antibiotika durch ein steriles Zellsieb gegeben. Anschließend wurde die Verdau- Lösung durch das Sieb filtriert. Im Anschluss wurde das Sieb erneut mit 4 ml DMEM/

20-%-FCS+Antibiotika geflutet. Durch das vorhandene FCS wurde die Verdaureaktion

Überstand wurde abgenommen und das Pellet in 3 ml DMEM/ 20-%-FCS+Antibiotika resuspendiert.

Zellkultur

Die Zelllösung wurde in 10 ml auf 37 °C vorgewärmten Wachstumsmedium in T-25 Zellkulturflaschen ausgesät und im Zellinkubator unter folgenden Bedingungen kultiviert: 37 °C, 95 % O2 und 5 % CO2. Die Flaschen waren mit Collagen-Typ I beschichtet. Das Wachstummedium setzte sich wie folgt zusammen:

- DMEM/F-12

- 20-%-fetales Kälberserum (FCS, hitzeinaktiviert) - 0,5 % Antibiotika (Penicillin/Streptomycin).

Der erste Mediumwechsel fand nach fünf Tagen mit zusätzlicher Subkultivierung der primären Passage (P0) durch Aufteilung der Zellen im Verhältnis 1:1 in die nächste Passage (P1) statt. Die entsprechenden Experimente wurden mit SMC der Passage zwei bis drei durchgeführt. Der Mediumwechsel erfolgte alle zwei Tage bzw. nach 70 - 80 % Konfluenz der Zellen. Es wurden Zellen für spätere Verwendung bei -80 °C eingefroren und gelagert. Für weitere Versuche wurden bei -80 °C eingefrorene Zellen kurz in einem Wasserbad (37 °C) erwärmt (< 1 min). Die erwärmten Zellen wurden Schritt für Schritt unter einer sterilen Sicherheitswerkbank mit laminarem Luftzug in die Zellkulturflaschen abpipettiert. Das Medium wurde am nächsten Morgen gewechselt, um das DMSO, in welchem die Zellen eingefroren wurden, zu entfernen.

2.4.3.1 Protein- und RNA-Isolation

Zur Protein- und Ribonukleinsäure (RNA)-Isolation wurden die Zellen auf 6-Well- Kulturplatten ausgesät.

Proteinisolation

Nachdem das jeweilige Medium vorsichtig abgesaugt wurde, wurden 60 µl Zell-Lyse- Puffer je Schale hinzugegeben. Die Zellen wurden mit Hilfe eines Zellschabers vorsichtig von der Versuchsplatte gelöst und in ein 1,5-ml-Reagenzgefäß überführt.

Dieses Lysat wurde über Nacht bei -20 °C gelagert, um die Proteinstruktur aufzubrechen. Am nächsten Tag wurde es 15 min bei 4 °C zentrifugiert (13000 rpm).

Das Sediment wurde verworfen und der Überstand wurde als Proteinlysat weiter

Quantitative Proteinanalyse

Zur Bestimmung der quantitativen Proteinmenge wurde die photometrische Bradford- Methode verwendet⁹⁶. Es wurde der Farbstoff Coomassie-Brillantblau benutzt, welcher im Komplex mit Proteinen ein Absorptionsmaximum bei 595 nm aufweist⁹⁷. Eine fehlende Komplexbildung erzeugt eine rötlich gefärbte Lösung mit einem Absorptionsmaximum bei 470 nm. Da die Proteinkonzentration in einer Lösung direkt proportional zur Höhe der Absorption des Komplexes ist, lässt sich unter Zuhilfenahme einer Standardreihe mit bovinem Serumalbumin (BSA) die Proteinkonzentration bestimmen. Die Proteinbestimmung wurde im zweifachen Ansatz durchgeführt.

RNA-Isolation

Die RNA-Isolation wurde mit Hilfe des RNeasy-Mini-Kits der Firma Qiagen nach Herstelleranleitung durchgeführt. Nachdem das Medium von 6-Schalen-Zellkulturplatten entfernt wurde, wurden pro Zellschalle 300 µl RLT-Puffer zur Lyse auf die Zellen gegeben und diese mit einem Zellschaber abgelöst.

Isolation

Das Lysat wurde im Anschluss auf die QIA-Shredder-Säule gegeben und bei 13000 rpm für 2 min zentrifugiert. Die Säule wurde verworfen, das Eluat mit 300 µl 70- prozentigem Ethanol gemischt und auf die RNeasy-Mini-Spin-Column-Säule gegeben.

Auch diese wurde 30 sek bei 13000 rpm zentrifugiert, 350 µl RW1-Lösung wurden auf die Säule gegeben und erneut 30 sek zentrifugiert. Das Eluat wurde anschließend verworfen.

DNase-Verdau

Es wurden 10 µl DNase-1-Stamm-Lösung mit 70 µl RDD Puffer gemischt. Die Lösung wurde auf die Säule gegeben und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 150 µl RW1-Lösung auf die Säule gegeben und 30 sek bei 13000 rpm zentrifugiert. Das Eluat wurde verworfen und die Säule wurde in ein neues Reagenzgefäß überführt. Es wurden wiederholt je 500 µl RPE-Lösung auf die Säule gegeben und für 30 sek bzw. für 2 min bei 13000 rpm zentrifugiert. Im Anschluss wurde die Säule erneut in ein neues Reagenzgefäß überführt und für 1 min zentrifugiert.

Eluierung

Der Säule, in einem 1,5 ml großen Reagenzgefäß befindlich, wurden 25 µl RNase- freies Wasser hinzugegeben. Durch eine anschließende Zentrifugation mit 13000 rpm für 1 min enthielt nun das Eluat die RNA. Anschließend erfolgte eine RNA- Konzentrationsmessung mit Hilfe des Nano Drop 2000 C (Thermo Scientific).

Reverse Transkriptase-Reaktion

Die RNA wurde nun mit Hilfe eines kommerziellen Kits nach Herstelleranleitung (High Capacity RNA-to-cDNA-Kit, Applied Biosystems) in komplementäre Desoxyribonukleinsäure (cDNA) umgeschrieben. Es wurden 9 µl Probe mit einer Menge von 1000 ng RNA mit 10 µl Puffer und 1 µl Reverse Transkriptase (RT) gemischt. Das Gemisch wurde anschließend 1 h bei 37 °C inkubiert, dann 5 min bei 95 °C aufgekocht und zum Schluss auf 4 °C heruntergekühlt. Die entstandene cDNA wurde im Verhältnis 1:4 mit destilliertem Wasser gemischt und bei -20 °C gelagert.

2.4.3.2 Polymerase-Kettenreaktion

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine Methode zur Vervielfältigung einzelner DNA-Abschnitte. Mit Hilfe der quantitativen Echtzeit PCR ist eine Quantifizierung der einzelnen DNA-Abschnitte möglich. Durch eine Fluoreszenzmessung erfolgt in Echtzeit die Quantifizierung der entstandenen DNA während des Zyklus.

Die quantitative Echtzeit-PCR wurde mit einem Gerät und einem Super-Mix der Firma Bio-Rad durchgeführt (Bio-Rad CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio- Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA und iQ™ SYBR® Green Super Mix; Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)). Das PCR-Programm umfasste 40 Zyklen bei einer Temperatur von 60 °C. SYBR Green ist ein Cyanid-Farbstoff, welcher doppelsträngige DNA sichtbar machen lässt.

Die verwendeten Primer für α-SMA, SM-MHC, Smoothelin, Caldesmon, Calponin, SERCA2A, PLB, GAPDH, TBP, B2M und ACTB werden in Kapitel 2.1.4 beschrieben.

Die SERCA2 hat zwei Isoformen: SERCA2a und SERCA2b. Zum größeren Anteil liegt die SERCA2b in SMCs vor. Es wurde ein Primer verwendet, der beide Isoformen detektiert. Alle Primer sind mit Hilfe der NCBI-Primer-BLAST⁹⁸ erstellt worden. Die Oligonukleotide wurden auf Dimere und Heterodimere mittels OligoAnalyzer 3.1⁹⁹ analysiert. Die Primer und die zu erwartenden PCR-Produkte wurden auf die

Ausbildung von Hairpin-Strukturen getestet und im Anschluss bei Eurofins MWG Operon LLC (Huntsville, AL, USA) bestellt¹⁰⁰. GAPDH, ACTB, B2M und TBP sind mit Hilfe des Genevestigators RefGenes (Nebion AG, Zürich; Switzerland)¹⁰¹ als potenzielle Referenzgene ausgesucht worden.

Die Expressionsstabilität für alle Referenzgene ist mit dem geNorm Algorithmus¹⁰² gemessen worden. Die unterschiedliche Expression wurde mit der 2^-ΔΔCt-Methode aus den Fluoreszenzwerten errechnet. Um die relative Änderung zu bestimmen, wurden die Werte auf das geometrische Mittel der drei stabilsten Referenzgene normalisiert. Alle Analysen wurden als dreifacher Ansatz konzipiert.

2.4.3.3 Western Blotting

Zusammensetzung der verwendeten Puffer siehe Kapitel 2.1.2 - 5 x Elektrophorese-Puffer

- Transferpuffer 1 x - Waschpuffer TBS-T

- Blockmedium Trockenmilch (5 %)

Zur quantitativen Bestimmung der Proteinexpression wurde das Verfahren des Western-Blots benutzt. Je Versuchsansatz wurden ca. 30 µg bis 100 µg Proteine mit einem reduzierenden Sample Buffer aufgekocht und anschließend auf ein vier bis zwölf prozentiges Bis-Tris-Gel (NuPAGE® SDS-PAGE Gel System, LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA) aufgetragen. Darauf wurden die Proteine mittels Elektrophorese in einer Mini-Trans-Blot-Kammer (BioRad, Hercules, Kalifornien, USA) der Größe nach getrennt (15 mA im Bereich des Sammelgels und 20 mA im Trenngel/Gel). Weiter wurden die Proteine im Transferpuffer auf eine Polyvinyliden-Difluorid (PVDF)-Membran (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Vereinigtes Königreich), die zuvor mit Methanol aktiviert wurde, transferiert. Der Transfer erfolgte entweder bei 30 V über Nacht, unter permanentem Rühren, oder 60 bis 90 min bei 100 V.

Am zweiten Tag wurde das Gel als Kontrolle mit Coomassie-Färbelösung gefärbt, nach anschließendem Waschen zur Dokumentation eingeschweißt und bei 4 °C gelagert. Die Membran wurde in TBS gewaschen und zur Ladekontrolle reversibel mit Ponceau- Lösung angefärbt. Nach erneutem dreimaligem Waschen wurde die Membran für 1 h mit einem Blockmedium geblockt, um unspezifische Bindungsstellen zu besetzen. Die