2. Ergebnis
2.5 Bedingte Permissivität der mutp53-Expression
2.5.2 Re-Expression von WAP-mutp53 R270H in bi-transgenen Tieren
mut-p53R270H T-Ag
Milz Lu nge zervik
aleM amm
a
Nie Le re
ber
Herz thorak
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Immunhistochemisch konnten beide Transgene spezifisch in Mammaepithelzellen nachgewiesen werden. Eine Ko-Lokalisierung von mutp53 und T-Ag wurde anhand von Immunfluoreszenzmarkierungen untersucht (Abb. 26).
Abb. 26: Immun-Doppel-Markierung von murinem, laktierendem, bi-transgenem WAP-mutp53R270H x WAP-T, Mammagewebe
A, D, G: mutp53R270H, Kaninchen anti-HA-Tag Antikörper, (grün);
B, E, H: T-Ag, Meerschweinchen anti-T-Ag Antikörper, (rot);
C, F, I: Ko-Lokalisierung von mutp53R270H und T-Ag in Mammaepithelzellen
T-Ag war in ca. 80% der Mammaepithelzellen im Nukleus lokalisiert, während mutp53R270H gleichzeitig sowohl im Zytoplasma und im Nukleus als auch in jedem Kompartiment einzeln in ca. 2% der T-Ag exprimierenden Zellen vorhanden war.
Wie in vitro (Kapitel 2.5.1) so führte auch in vivo die gleichzeitige T-Ag Expression zu einer Expression von mutp53 in einem geringen Prozentsatz (ca. 1%) der Mamma-epithelzellen.
H
G I
E
D F
B
A C
Die WAP-T x CB6-22 bi-transgenen Tiere sind schwer zu züchten, da die Weibchen anscheinend Schwierigkeiten haben, die Jungen zu säugen. Diese sterben, bevor sie von einer Amme ernährt werden können. Probleme, die Jungen zu säugen, sind ebenfalls von den parentalen WAP-T Mäusen bekannt. Allerdings können diese den ersten Wurf groß ziehen. Zu Schwierigkeiten kommt es erst bei den folgenden Wür-fen, weshalb ein Zuchterhalt mit transgenen Männchen durchgeführt werden muss.
Die Ursache hierfür sind sich schnell entwickelnde pathologische Veränderungen des Drüsengewebes (Schulze-Garg et al., 2000).
Das Langzeitverhalten dreier weiterer WAP-T x CB6-22 bi-transgenen Weibchen wurde in einer Dauerverpaarungs-Situation beobachtet. Sehr auffällig erschienen auch hier die Schwierigkeiten beim Säugen der Nachkommen. Ein bi-transgenes Weibchen konnte zwei Würfe gebären, aber davon nur den ersten Wurf großziehen.
Zwei weitere bitransgene Weibchen konnten trotz vermehrten Verpaarungen nur jeweils einen Wurf austragen. Von diesen konnte ein Tier die Nachkommen säugen und großziehen, während das zweite Tier seine Nachkommen nicht großziehen konnte. Nach einem Zeitraum von acht Monaten entwickelten alle drei Tiere Mam-makarzinome, wobei das Tier, das seinen einzigen Wurf nicht großziehen konnte, wesentlich größere, sichtbare (0,6-0,8 cm im Durchmesser) Tumore zeigte, als das andere (0,1-0,4 cm im Durchmesser), das seinen Wurf aufzuziehen vermochte. Das Tier mit zwei Würfen besaß einen makroskopisch sichtbaren Tumor von 0,4 cm. Bei der Präparation dieser Tiere fiel auf, dass alle Mammadrüsen viele kleine, makroskopisch sichtbare Knötchen (0,5-1 mm) aufwiesen.
Histologische und immunhistologische Untersuchungen des Mammagewebes zeig-ten unterschiedliche Stadien der Tumorentwicklung, von ductalem Carcinoma in situ (DCIS) bis hin zu invasiven Karzinomen (Abb. 27 A). Dabei war ganz besonders die Verteilung mutp53-immunmarkierter (HA-Tag+) Tumorzellen auffällig. In ausgedehn-ten und invasiven Karzinomen sind 80% oder mehr der Tumorzellen mutp53-positiv, während in sogenannten intraepithelialen Neoplasien oder DCIS-Strukturen keine oder eine geringe mutp53-Expression von ca. 1-2% zu beobachten war (Abb. 27 B).
SV40 T-Ag (Abb. 27 D) und entsprechend wtp53 (Abb. 27 C) waren dagegen global in allen Arten von malignen Tumoren lokalisiert. Wie in mono-transgenen WAP-T Tieren beobachtet (Schulze-Garg et al., 2000), konnte auch in diesen bi-transgenen Tieren die Tumorprogression in einem invasiven Karzinom unabhängig von T-Ag-Expression werden, so dass die Immunfärbung mit der Tumor-Progredienz abnamm.
Hinsichtlich der p53-Immunmarkierung der invasiven Karzinome ist zu bedenken, dass auch mutp53 zur intensiven Immunfärbung des Karzinoms neben wtp53 bei-trägt.
Es war auffällig, dass mutp53 offensichtlich bevorzugt in sehr weit fortgeschrittenen Tumoren exprimiert wurde. Hier könnte eventuell ein erster in vivo Hinweis
vorlie-gen, dass mutp53 T-Ag transformierten Zellen einen Wachstumsvorteil verleiht. Sie könnten dadurch einen Selektionsvorteil gegenüber nicht mutp53 exprimierenden Zellen haben.
Abb. 27: Histopathologie und Immunhistologie von murinem Mammagewebe einer bi-transgenen WAP-mutp53R270Hx WAP-T Linie
A: Rechts im Bild ist ein invasives Adenokarzinom (*) der murinen Mamma abgebildet, während in der linken Hälfte vorwiegend in situ Karzinome (∆) dargestellt sind H&E.
B: Die HA-Tag – Immunmarkierung zeigt eine starke mutp53-Expression in dem invasivem Adenokar-zinom (*), während der Bereich mit in situ KarAdenokar-zinomen negativ bleibt.
C+D: Die p53- (C) und T-Ag- (D) Immunmarkierung finden sich im Gegensatz zu HA-Tag (B) Darstel-lung sowohl in intraepithelialen Neoplasien wie in in situ Karzinomen.
Vergrößerung: A-D: x 100.
*
*
∆
*
*
∆
A B
C D
Es wurde ebenfalls die niedrig exprimierende Linie CB6-4 (WAP-mutp53R245W) mit WAP-T verpaart. Am Tag vier post partum zeigten sich bei einem bi-transgenen Weibchen keine morphologischen Veränderungen. In diesem Fall konnte die mutp53-Expression durch die Ko-Expression von T-Ag nicht gesteigert werden. Nach drei Würfen entwickelten sich makroskopisch feststellbare Tumore.
In diesem bi-transgenen Tier entwickelten sich große aggressiv wachsende Adeno-karzinome in der Brustdrüse (Abb. 28 A) neben intraepithelialen Neoplasien (DCIS) (Abb. 28 B). Auch hier war die Verteilung von mutp53-Proteinen sehr auffällig. Wie in der zuvor beschriebenen transgenen Linie wurde mutp53 mit Hilfe einer HA-Tag-Immunmarkierung detektiert. In Adenokarzinomen (Abb. 28 C) konnte eine generelle Immunmarkierung der Tumorzellen festgestellt werden, während DCIS-Strukturen nur zu einem sehr geringen Prozentsatz eine HA-Tag-Immunmarkierung zeigten (Abb. 28 D). Auch hier fiel auf, dass die mutp53-Expression vorzugsweise in den invasiven Adenokarzinomen erfolgte.
Wtp53 (Abb. 28 E) und T-Ag (Abb. 28 F) wurden in DCIS-Strukturen und in Adeno-karzinomen detektiert.
Bei der mikroskopischen Untersuchung dieser Mammakarzinome fiel auf, dass im Gegensatz zur Situation bei den mono-transgenen WAP-T Linien ein Eindringen der Tumore in das Blut (Vene) – und Lymph – Gefäßsystem zu beobachten war.
Zusammengefasst könnte man aufgrund dieser Hinweise mit Vorbehalt schließen, dass Tumor -Differenzierung und -Progredienz durch mutp53 gefördert werden.
Abb. 28: Histopathologie und Immunhistologie von murinem Mammagewebe einer bi-transgenen WAP-mutp53R245Wx WAP-T Linie
A: Invasives, tubuläres Adenokarzinom der murinen Mamma mit einem hohen Kerngrading Index.
H&E
B: Intraepitheliale Neoplasien und DCIS-Strukturen der murinen Mamma. H&E
C: Globale HA-Tag-Immunmarkierung im invasiven, tubulären Adenokarzinom der murinen Mamma.
D: Geringe HA-Tag-Immunmarkierung in intraepithelialen Neoplasien und DCIS-Strukturen der muri-nen Mamma (Pfeil).
E+F: Die p53- (E) und T-Ag- (F) Immunmarkierung finden sich im Gegensatz zur HA-Tag (C) Darstel-lung sowohl in intraepithelialen Neoplasien wie in in situ Karzinomen.
Vergrößerung: A-F: x 100.
A B
C D
E F
3. Diskussion
In 50-60% aller Malignome des Menschen werden Mutationen im Gen des Tumor-suppressors p53 gefunden. 90% dieser Mutationen sind Missense-Punktmutationen, die hauptsächlich in der zentralen DNS-Bindungs-Domäne des p53-Moleküls liegen und zur Expression eines p53-Proteins mit einem einzigen Aminosäure-Austausch führen (mutp53). Das spezifische p53-Mutationsspektrum, das sich durch überpro-portional häufige Hot-Spot-Punktmutationen auszeichnet, impliziert, dass während der Tumorentstehung und Tumorprogression auf genau diese Mutationen selektio-niert wird und sie den Tumorzellen somit einen selektiven Wachstumsvorteil verlei-hen. Durch bestimmte p53-Mutationen wird nicht nur die Tumorsuppressor-Aktivität des wtp53-Proteins ausgeschaltet (loss of function), sondern werden auch neue biochemische Aktivitäten (gain of function) hinzugewonnen. Sowohl aufgrund von in vitro Daten als auch aufgrund statistischer Korrelationsanalysen von Tumor-Datenbanken werden mutp53-Proteinen dominant-onkogene Eigenschaften zuge-schrieben. Für das Mammakarzinom wurde gezeigt, dass die Expression bestimmter mutp53-Proteine mit einer schlechteren Prognose korreliert. Dabei gibt es Unter-schiede zwischen einzelnen Punktmutationen (Hernandez-Boussard et al., 1999).
Mutations-Studien für das Mammakarzinom zeigen eine signifikante Abnahme der Überlebensrate in Abhängigkeit von bestimmten p53-Mutanten (Borresen-Dale 2003). Diesen Beobachtungen zu Folge scheint mutp53 onkogenes Potential zu besitzen, welches die Tumorprogression fördert.
Um das postulierte onkogene Potential in einem experimentellen Ansatz zu testen, wurde in dieser Arbeit ein transgenes, induzierbares mutp53-Mausmodell generiert.
Die Expression von mutierten p53-Proteinen wird in diesen transgenen Tieren spezi-fisch in Mammaepithelzellen induziert, um die Auswirkungen von p53-Mutationen am Beispiel der Tumorigenese eines Mammakarzinoms zu analysieren.