Polymerasekettenreaktion (PCR)

Restriktionsschnittstellen am 5´ Terminus von Oligonukleotidprimern, die nicht kom-plementär zu der zu amplifizierenden DNS sind, erlauben nach einem Restriktions-verdau die ortsgerichtete Klonierung der PCR-Produkte in ein Plasmid.

5.1.4.1 PCR-Amplifizierung und Sub-Klonierung der Transgen-Konstrukte

Die PCR-Amplifizierungen zur Herstellung des Transgen-Konstruktes wurden mit der Herkulase^TM Enhanced DNS-Polymerase durchgeführt. Dabei handelt es sich um eine Kombination aus vornehmlich Pfu DNS-Polymerase, einem PfuTurbo^®

PCR-„enhancing factor“und einer kleinen Menge an Taq2000^TM DNS-Polymerase. Die Pfu Polymerase hat eine der niedrigsten Fehlerraten thermostabiler DNS-Polymerasen. Sie besitzt mit 1,3 x 10^-6 eine wesentlich geringere Fehlerrate als die Taq DNS-Polymerase mit 8 x 10^-6. Zusätzlich haben alle anderen thermostabilen Polymerasen, außer der Pfu DNS-Polymerase, eine terminale Deoxynukleotid-Transferase-Aktivität (TdT). Diese Aktivität ist durch die Addition von Nukleotiden am 3´Terminus von PCR generierten Fragmenten charakterisiert, die unabhängig von einem komplementären DNS-Strang sind. Die Pfu DNS-Polymerase gerneriert exklu-siv PCR-Produkte mit glatten Enden, ohne jeglichen Überhang.

Der PfuTurbo^® PCR-„enhancing factor“ ist ein optimierter Puffer, der eine hohe Aus-beute und Spezifität für die Amplifizierung von sehr langen Ziel-Sequnezen ermög-licht.

Eine terminale PCR-Mutagenese diente beispielsweise zur Einführung von Restrikti-onsschnittstellen oder zur Markierung mit einem Tag an einem oder an beiden Ter-mini. Bei einem kurzen bis zu acht Nukleotiden langen nicht zur Ziel-Sequenz kom-plementären Nukleotidbereich weicht das PCR-Programm nicht von dem üblichen Protokoll ab. Bei längeren Sequenzen wie z.B. bei der Einführung eines HA-Tags mit zusätzlichen Sequenzen für einen flexiblen Linker und zwei Restriktionsschnittstellen, sind 48 von 70 Nukleotiden nicht komplementär zur Ziel-Sequenz (Primer: FKR11, Primerliste). In den ersten Zyklen hybridisieren z.B. bei Oligonukleotidprimer FKR11 nur 22 Nukleotide mit der DNS-Ziel-Sequenz, während 48 Nukleotide keine komple-mentäre Sequenz zur Verfügung haben. Nach erfolgreicher Amplifizierung entstehen ab der dritten Runde DNS-Fragmente, zu denen der Primer vollständig komplemen-tär ist. Diese ersten Runden der Amplifizierung sind sehr kritisch, dementsprechend wurde die Hybridisierungszeit verlängert.

Ausgehend von dem Vektor pLTRp53cGwt wurden die p53-Abschnitte A (mit Primer:

FKR10, FKR13) und B (mit Primer: FKR12, FKR11) von der Herkulase^TM Enhanced DNS-Polymerase folgendermaßen hergestellt.

Die Reaktion fand in einem Volumen von 50 µl unter folgenden Bedingungen statt:

PCR-Puffer (1x), dNTPMix (0,2 mM), Primer 1 (0,5 µM) (FKR10, bzw. FKR12), Pri-mer 2 (0,5 µM) (FKR13, bzw. FKR11), Herkulase DNS PolyPri-merase (0,05 U/µl). Als Ausgangs-DNS wurden ca. 100 ng Plasmid-DNS (pLTRp53cGwt) eingesetzt. Das PCR-Programm wurde für die Reaktionen optimiert: Initiale Denaturierung (3 Min, 92°C), 35 Zyklen: Denaturierung (30 Sek., 92°C), Annealing (1 Min. 30 Sek., 60 °C), Elongation (3 Min., 72°C), abschließende Elongation (5 Min., 72°C).

Im Anschluß an die PCR wurden die amplifizierten PCR-Produkte in einem Agarose-gel analysiert und extrahiert. Ein Aliqout des extrahierten PCR-Produktes wurde zusätzlich durch SmaI (für p53-Abschnitt A) bzw. HindIII (für p53-Abschnitt B) Re-striktion charakterisiert. Anschließend wurden die extrahierten PCR-Produkte in die AvaI Restriktionsschnittstelle von pUC18 kloniert. Vor der Ligation wurde pUC18 mit dem Klenow Fragment und anschließend mit der Shrimp Alkalischen Phosphatase inkubiert, um die Enden zu glätten und den Vektor zu dephosphorylieren.

Eliminierung einer EcoRI Restriktionsschnittstelle im mutiertem Transgen-Konstrukt Für die Eliminierung der EcoRI Restriktionsschnittstelle wurde ebenfalls die Herkula-se^TM Enhanced DNS-Polymerase verwendet, weil es für die Herstellung des Trans-gen-Konstruktes von entscheidener Bedeutung war, die Fehlerrate der Polymerase auf ein Minimum zu beschränken. Das Transgen-Konstrukt musste bis auf die gezielt eingeführten Mutationen Wildtyp Sequenzen enthalten. Für diese PCR wurden die Vektoren pUC-mutp53^R245W und pUC-mutp53^R270H eingesetzt. Die EcoRI Restriti-onsschnittstelle hinter der BglII RestriktiRestriti-onsschnittstelle wurde durch die Herkulase^TM Enhanced DNS-Polymerase folgendermaßen entfernt.

Die Reaktion fand in einem Volumen von 50 µl unter folgenden Bedingungen statt:

PCR-Puffer (1x), dNTPMix (0,2 mM), Primer 1 (FKR10) (0,5 µM), Primer 2 (p53BglII) (0,5 µM), Herkulase DNS-Polymerase (0,02 U/µl). Das PCR-Programm wurde für die Reaktionen optimiert: Initiale Denaturierung (3 Min, 92°C), 35 Zyklen: Denaturierung (30 Sek., 92°C), Annealing (30 Sek., 62 °C), Elongation (4 Min., 15 Sek., 72°C), abschließende Elongation (5 Min., 72°C).

5.1.4.2 Unique site elimination (U.S.E.) Mutagenese

Die unique site elimination (U.S.E.) Mutagenese ermöglicht eine schnelle und effi-ziente positionsspezifsche Mutagenese (Deng and Nickoloff 1992). Die U.S.E. Muta-genese basiert auf dem Prinzip zusätzlich zu der gewünschten, oft nicht selektionier-baren Mutation eine zweite selektionierbare Mutation auf einem DNS-Strang einzu-führen. Die zweite Mutation eliminiert eine singuläre nicht-essentielle

Restriktions-schnittstelle in dem Plasmid (unique site elimination); hier wurde die ScaI Restrikti-onsschnittstelle in pUC18 durch eine MluI RestriktiRestrikti-onsschnittstelle ersetzt.

Da beide Primer zur Einführung der Mutation an den gleichen Strang der denaturier-ten Plasmid-DNS banden, war es durch die Verwendung einer T4 DNS-Polymerase möglich einen neuen DNS-Strang zu synthetisieren, der beide Mutationen enthielt.

Eine Voraussetzung dafür ist die fehlende 5´Æ3´ Exonuklease-Aktivität der T4 DNS-Polymerase, so dass sie die Primer während der Polymerisation nicht ersetzen (oder verdrängen) kann.

In einer anschließenden Selektion wurde mit dem Restriktionsenzym, dessen Schnittstelle eliminiert wurde, geschnitten. In dem Restritkionsansatz aus mutierten und nicht-mutierten Plasmiden wurden dadurch nicht-mutierte Plasmide linearisiert.

Lineare DNS Fragmente wurden mit einer 100 – 1000 fach geringeren Effizienz als die zirkulären mutierten Plasmide in Reparatur-defiziente E.coli NM522 mutS Bakte-rien transfomiert. Eine weitere ScaI Restriktion, der aus diesen BakteBakte-rien wieder isolierten Plasmide, führte nach nochmaliger Transformation zu einer hohen Ausbeu-te an mutierAusbeu-ten Plasmiden.

Die praktische Durchführung dieser Mutagenese richtete sich nach den Angaben des Herstellers (Pharmacia Biotech).

Die Muatgenese-Primer FKR17 (724ggc atg aac TgG cga cct atc c745 im p53 Exon VII) zur Erzeugung der mutp53^R245W Mutation und FKR16 (797gc ttt gag gtt cAt gtt tgt gcc819 im p53 Exon VIII) zur Erzeugung der mutp53^R270H Mutation wurden jeweils mit dem Selektionsprimer FKR18 (2192gac ttg gtt g a´cgcgt ca cca gtc aca g2165 im pUC18) kombiniert, um die Mutationen in pUC-wtp53-B einzuführen. Der Selektions-primer FKR18 eliminierte die ScaI Restriktionsschnittstelle in pUC18 und ersetzt sie durch eine MluI Restriktionsschnittstelle. FKR16 musste zuvor für eine mögliche Ligation in E. coli kinasiert wurden. FKR 17 und FKR18 sind am 5´Terminus phosphoryliert.

Nach der zweiten Transformation wurde zur Identifizierung mutierter Plasmide die Plasmid DNS verschiedener Klone mit MluI und EcoRI geschnitten. EcoRI schneidet das 2,2 kb p53 Fragment (Abschnitt B) heraus. War das Plasmid mutiert, teilt MluI das 2,6 kb pUC18 Fragment in ein 900 Bp und ein 1700 Bp Fragment.

Standard PCR

Primer Zugabe Standard PCR Aufreinigung der beiden PCR-Ansätze

überlappende PCR

xx x x

xx

xx

xx

B C A

D 1.

2.

3.

A

D 4.

5.1.4.3 Overlap extension PCR Mutagenese

Das Prinzip der Overlap-Extension-PCR-Mutagenese besteht darin, im ersten Schritt zwei PCR-Produkte in unabhängigen Reaktionen zu erzeugen (Abb. 29). Über die verwendeten Primer wurden die gewünschten Mutationen eingeführt. Jeweils ein Ende der erzeugten PCR-Produkte muß hierbei überlappen (Rychlik 1995), (Ge and Rudolph 1997).

Diese PCR-Produkte wurden (über das JetSorb-Kit der Firma Genomed) isoliert.

Anschließend wurden die isolierten Fragmente zusammen mit dNTP´s, der Herkula-se^TM Enhanced DNS Polymerase und Herkulase PCR-Puffer ohne die Zugabe von Primern inkubiert. Nach Denaturierung hybridisieren die überlappenden Enden der PCR-Produkte. Anhand der überhängenden 5´-Termini verlängert die Herkulase^TM Enhanced DNS Polymerase die 3´-Termini zu einem komplementären DNS-Doppelstrang. Nach 5 PCR-Zyklen wurden die außen liegenden Primer des ge-wünschten Fusionsproduktes zugegeben und eine PCR durchgeführt.

Abb. 29: Overlap-Extension-PCR-Mutagenese

1. Durchführung zweier unabhängiger PCR-Mutagenesen mit den Primerpaaren A, B und C, D. Die Primer B und C enthalten jeweils die einzuführende Mutation. 2. Gelextraktion der PCR-Amplifikate. 3.

Durchführung der Overlap-Extension-PCR. 4. Zugabe der äußeren Primer A und D. Amplifizierung des Fragmentes in gesamter Länge.

Aufgrund der proofreading-Aktivität der Pfu-Polymerase wurden für den Mutagenese-Primer sowohl auf der 5´- als auch auf der 3´-Seite mindestens zehn korrekt gepaar-te Basen empfohlen.

Zur Erzeugung der Mutation mutp53^R172H wurde in der Overlap-Extension-PCR pUC-wtp53-HA als Matrize eingesetzt. In den ersten zwei getrennten PCR Ansätzen wur-den überlappende PCR-Produkte erzeugt. Die Mutation im murinen p53 an Nukleo-tidposition 515 wurde dabei durch die Primer FKR7 (501g gag gtc gtg aga cAc tgc ccc cac c525, p53 Exon V) in Kombination mit FKR10 (gct cag tag ccc´ ggg a1tg act gcc atg gag gag tca c23, p53 Exon II), bzw. durch Primer FKR6 (525g gtg ggg gca gTg tct cac gac ctc c501,p53 Exon V) in Kombination mit p53-BglII (gca cag ata ata gat´ct tca ggc gta gtc ggg c) eingeführt.

Der erste Schritt fand in einem Volumen von 50 µl unter folgenden Bedingungen statt: PCR-Puffer (1x), dNTPMix (0,2 mM), Herkulase DNS Polymerase (0,02 U/µl), Primer A (0,5 µM), Primer B (0,5 µM), bzw. Primern C und D. Als Ausgangs-DNS wurden ca. 100 ng Plasmid-DNS (pUC-wtp53-HA) eingesetzt. PCR-Programm: Initia-le Denaturierung (3 Min, 92°C), 35 ZykInitia-len: Denaturierung (30 Sek., 92°C), Annealing (20 Sek., 66 °C), Elongation (2 Min. 10 Sek., 72°C), abschließende Elongation (5 Min., 72°C).

Nach der anschliessenden Agarosegelelektrophorese (1 % Gel), wurden die beiden PCR-Banden aus dem Gel extrahiert.

Der zweite Schritt fand in einem Volumen von 50 µl unter folgenden Bedingungen statt: PCR-Puffer (1x), dNTPMix (0,2 mM), DMSO 5%, Herkulase DNS Polymerase (0,02 U/µl), 20 ng des Isolates (A-B), 20 ng des Isolates (C-D). PCR-Programm: Initiale Denaturierung (2 Min, 92°C), 5 Zyklen: Denaturierung (30 Sek., 92°C), Annealing (60 Sek., 50°C), Elongation (3 Min., 72°C), Pause für ca. 5 Min., 4°C).

Zugabe der außenliegenden Primer in diesen PCR-Ansatz. 0,5µl Primer A (50 µM) und 0,5µl Primer B (50 µM)

PCR-Programm für dritten Schritt: Initiale Denaturierung (2 Min, 92°C), 35 Zyklen:

Denaturierung (30 Sek., 92°C), Annealing (40 Sek., 62°C), Elongation (4 Min. 15 Sek., 72°C), abschließende Elongation (5 Min., 72°C).

Der PCR-Ansatz wurde in einer Agarosegelelektrophorese analysiert und das Ampli-fikat aufgereinigt.