4. Material
4.4 Molekularbiologisches Material
4.4.1 Plasmide
pLTRp53cGwt die chimaere, murine p53 DNS (4,03 Kb) steht unter der Kontrolle des murinen Harvey Sarcoma Virus Promotors, Enhancers und der cap sites (retroviraler 5´LTR); kloniert in pBR322, (Eliyahu et al., 1985)
pWAP-T die frühe Genregion des SV40 Virus steht unter der Kontrolle des murinen whey acidic protein (WAP)-Promotors; kloniert in pUC18 (Tzeng et al., 1993)
pUC18 Klonierungsvektor; GI: 209210
pCMV-Neo-Bam eukaryotischer Expressionsvektor mit CMV-Promotor, Ampicil-lin- und Neomycin-Resistenz zur Etablierung stabil exprimie-render Zell-Linien (Baker et al., 1990)
pCI-Neo Eukaryotischer Expressionsvektor mit CMV Promotor, Ampicil-lin- und Neomycin-Resistenz zur Etablierung stabil exprimie-render Zell-Linien (Fu et al., 1991)
4.4.2 Enzyme
Die aufgelisteten Enzyme wurden jeweils mit dem dazugehörigen Puffer verwendet.
Restriktionsenzyme New England Biolabs, Frankfurt a.M.
Shrimp alkalische Phosphatase Roche, Basel
Klenow Fragment MBI Fermentas
T4-Ligase Roche, Basel
Taq-DNS-Polymerase Eppendorf, Hamburg
HerkulaseTM-DNS-Polymerase Stratagene, La Jolla
RNase A Sigma-Aldrich, Taufkirchen
DNase I RNase-frei Promega, Madison, USA
Proteinase K Sigma-Aldrich, Taufkirchen Hyaluronidase, Embryonen getestet Sigma-Aldrich, Taufkirchen
4.4.3 Antikörper
Folgende Antikörper wurden für Western-Blot Analysen und immunhistologische Methoden verwendet.
- anti-HA Polyklonal, Code-Nr.: 561, Kaninchen-Antiserum (Mo Bi Tec, Göttin-gen)
- anti-p53 polyklonal, Kaninchen-Antiserum (Arbeitsgruppe Prof. Deppert, HPI, Hamburg)
- anti-T-Ag polyklonal, Meerschweinchen-Antiserum gegen denaturiertes SV40 T-Antigen (Arbeitsgruppe Prof. Deppert, HPI, Hamburg)
Zur Detektion der primären Antikörper wurden folgende sekundäre Antikörper einge-setzt:
Ziege anti-Kannichen IgG (H+L) Peroxidase gekoppelt (Biomol, Hamburg) Ziege anti-Meerschweinchen IgG (H+L) Peroxidase gekoppelt (Dianova, Hamburg) Esel anti-Kannichen IgG (H+L) CyTM2-gekoppelt (Dianova, Hamburg) Esel anti-Meerschweinchen IgG (H+L) CyTM3-gekoppelt (Dianova, Hamburg)
4.4.4 Primer
Die für die Klonierungen, Mutagenesen, Sequenzierungen und die Genotypisierung benötigten Primer sind in Tabelle 8 aufgeführt.
Tabelle 8: Primer
Primer bp Orien. Tm Mod. GC
%
Org. Beschreibung Einsatz in Sequenz 5´- 3´
FKR 2 20 Ö 68 - 70 Maus murines p53 Exon XI;
Pos.: 987-1006
Sequenzierung 987c cgc ggg cgt aaa cgc ttc g1006
FKR 4 21 Õ 72 - 71
HA-Tag
letzten sechs Codons des HA-Tag ( A Y D P V D)
Transgen-Identifizierung
ca ggc gta gtc ggg cac gtc g FKR 6 26 Õ 88 5´-P 69 Maus murines p53 Exon V; Pos.:
525-501; p53R172H Hot Spot Mutation: Pos. 515 G → A
Mutagenese 525g gtg ggg gca gTg tct cac gac ctc c501
FKR 7 26 Ö 88 5´-P 69 Maus murines p53 Exon V; Pos.:
501-525; p53R172H Hot Spot Mutation: Pos. 515 G → A
Mutagenese 501g gag gtc gtg aga cAc tgc ccc cac c525
FKR 10 37 Ö 70 5´-P 62 Maus SmaI Restriktionsschnittstelle, murines p53 Exon II;
Pos. 1-23
Klonierung gct cag tag ccc´ ggg a1tg act gcc atg gag gag tca c23
FKR 11 70 Õ 70 5´-P 60 Maus EcoRI, BglII Restriktions-schnittstellen, stop codon, HA-tag (AYDPVDYPY), linker (GG), murines p53 Exon XI;
Pos.: 1170 – 1149
Mutagenese g´aattc agat´ct tca ggc gta gtc ggg cac gtc gta ggg gta gcc gcc 1170gtc tga gtc agg ccc cac ttt c1149
FKR 12 24 Ö 72 5´-P 50 Maus murines p53 Exon VI;
Pos.: 578 – 601
p53 Subklonierung
578gg gtg gaa gga aat ttg tat ccc g601
FKR 13 23 Õ 74 5´-P 61 Maus murines p53 Exon VI;
Pos.: 661 – 639
p53 Subklonierung
661c ggg tgg ctc ata agg tac cac c639
FKR 14 24 Ö 70 - 46 Maus murines p53 Exon IX;
Pos.: 961 – 984
Transgen-Identifizierung
961gat gga gag tat ttc acc ctc aag984
FKR 16 23 Ö 68 - 48 Maus murines p53 Exon VIII; Pos.:
797 – 819; p53R270H Hot Spot Mutation: Pos. 809 G→ A
Mutagenese 797gc ttt gag gtt cAt gtt tgt gcc819
FKR 17 22 Ö 70 5´-P 59 Maus murines p53 Exon VII; Pos.:
724 – 745; p53R245W Hot Spot Mutation:
Pos. 733 C→ T, 735 C→ G
Mutagenese 724ggc atg aac TgG cga cct atc c745
FKR 18 28 Õ 88 5´-P 57 pUC18 Selektionsprimer im pUC18 Pos. 2192 – 2165
ScaI (agt´act) wird durch MluI (a´cgcgt) ersetzt
Mutagenese 2192gac ttg gtt g a´cgcgt ca cca gtc aca g2165
p53-BglII
33 Õ 70 5´ P 52
HA-Tag
BglII Restriktionsschnittstelle;
Stop Codon; 4 Aminosäuren des HA-Tags (AYDP)
Klonierung;
Eliminierung der EcoRI Schnittstelle aus FKR11
gca cag ata ata gat´ct tca ggc gta gtc ggg c
p53-I2 20 Õ 57 - 50 Maus murines p53 Intron 2 Sequenzierung Exon II
gaa tct cac tta tcc cag gc
WAP1955 23 Ö 72 - 55 Maus muriner WAP- Promoter, Start bei Pos. 1955
Transgen-Identifizierung
cca gga gaa gtc acc ctc aga tg
p53EIII 24 Õ 72 - 50 Maus murines p53 Exon III;
Pos.: 103-84 und 6 Nukleotide aus Intron 2
Transgen-Identifizierung
103g gat atc ttc tgg agg aag t84 ctgg
p53I9 24 Ö 72 - 50 Maus murines p53 Intron 9 Transgen-Identifizierung
gta agt gga gcc agc tta agt tgg
p53EXI 23 Õ 72 - 55 Maus murines p53 Exon XI; Pos.:
1164 – 1142
Transgen-Identifizierung
1164gtc agg ccc cac ttt ctt gac ca1142
mp53-VIII Õ - Maus murines p53 Exon VIII; Pos. : 889-867
Identifizierung stabiler Klone
gcagttcagggcaaag-gacttcc
oIMR 013
20 Ö 62 - 55 Maus Neo-Kassette; Pos.:
3905-3924
Identifizierung p53+/+, +/-, -/-
ctt ggg tgg aga ggc tat tc
oIMR 014
20 Õ 60 - 50 Maus Neo-Kassette; Pos.:
4185-4165
Identifizierung p53+/+, +/-, -/-
agg tga gat gac agg aga tc
oIMR 336
17 Õ 52 - 53 Maus murines p53 Exon VII ; Pos. : 743-727
Identifizierung p53+/+, +/-, -/-
ata ggt cgg cgg ttc at
oIMR 337
20 Ö 62 - 55 Maus murines p53 Exon VI ; Pos. : 598-617
Identifizierung p53+/+, +/-, -/-
ccc gag tat ctg gaa gac ag
AC 28 Ö
65
- 46 SV40 Pos. 3666 – 3692 im SV40 Genom, bzw. Pos. 1133 – 1160 in der SV40 early region im WAP-T Plasmid
Transgen-Identifizierung:
WAP-T
3666tat gtc agc aga gcc tgt aga acc aaa c3692
DC 22 Õ
60
- 50 SV40 Pos. 4431 – 4410 im SV40 Genom, bzw. Pos. 1898 – 1877 in der SV40 early region im WAP-T Plasmid
Transgen-Identifizierung:
WAP-T
4431gag aaa ggt aga aga ccc caa g4410
LT-Stop 22 Ö 70 - 59 SV40 Position 2695 – 2716 im SV40 Genom
für RT-PCR 2695gtt tca ggt tca ggg gga ggt g2716
LT-Start 27 Õ 72 - 33 SV40 Position 5161 – 5135 im SV40 Genom
für RT-PCR 5161gga taa agt ttt aaa cag aga gga atc5135
Bp.: Anzahl der Basenpaare des aufgeführten Primers.
Orien.: Orientierung des aufgeführten Primers, vorwärtsgerichteter Primer (Ö), rückwärtsgerichteter Primer (Õ).
Tm: Schmelztemperatur des Primers.
Mod.: 5´ Modifizierung des Primers.
GC %: prozentualer Anteil von Guanosin und Cytosin im Primer.
Org.: Organismus, aus dem die DNS-Sequenz des aufgeführten Primers stammt.
Pos.: Nukleotidposition im murinen p53 Gen (Eliyahu et al., 1985), bzw. im SV40 Genom.
WAP-T: Transgenkonstrukt: frühe SV40 Genregion, kodierend für das große T-Antigen und das kleine t-Antigen unter der Kontrolle des whey acidic protein (WAP)-Promotors.
4.4.5 Molekulargewicht-Standards
Für die Größenzuordnung bei der gelelektrophoretischen Auftrennung von DNS und Proteinen wurden folgende Molekulargewicht-Standards benutzt:
1 Kb DNS-Standard 1 Kilo Basen DNS-Marker, Gene Ruler; MBI Fermentas 100 Bp DNS-Standard 100 Basen DNS-Marker, Gene Ruler; MBI Fermentas Protein-Standard SDS-7B Prestained Mixture Sigma-Aldrich, Taufkirchen