Proteinchemische Methoden

3.2.3.1 Isolierung von Proteinen

Für die Generierung von Gesamtzellextrakten für eine SDS-PAGE wurden 1 x 10⁶ Zellen bei 400 x g, RT für 5 Minuten zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit 50 µl Lysepuffer resuspendiert und für 10 Sekunden sonifiziert. Nach einer Inkubationszeit von 5 Minuten auf Eis, wurden die lysierten Zellen bei 17000 x g, 4 °C für 10 Minuten abzentrifugiert und der Überstand für eine Proteinbestimmung weiterverwendet.

Um eine Degradierung empfindlicher Proteine zu vermeiden, wurde das Zellpellet direkt in 50 bis 100 µl heißem SDS-Ladepuffer resuspendiert, 5 Minuten bei 95 °C inkubiert und anschließend auf ein Tris-Glycin-Gel geladen oder bei - 20 °C eingefroren.

Für die Herstellung eines Zellextraktes für die Analyse transkriptioneller Aktivität wurden 1 x 10⁶ Zellen in 50 µl PLB (Passive Lysis Buffer) lysiert und 15 Minuten bei 4 °C geschüttelt. Der Zellextrakt wurde bei 17000 x g, 4 °C für 10 Minuten abzentrifugiert und der Überstand bei -80 °C eingefroren.

3.2.3.2 Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Messung der Proteinkonzentration erfolgte mit der Bradford-Methode mit Hilfe des Bio-Rad Protein Assays in 96-Well-Platten (Bradford 1976). Für den Standard wurde eine Verdünnungsreihe aus einer Rinderserumalbumin-Lösung verwendet. Die Bestimmung der Proteinmenge wurde gemäß den Herstellerangaben in Dreifachbestimmung mittels ELx808 Absorptions-Reader durchgeführt.

3.2.3.3 Reportergendetektion

Die transkriptionelle Aktivität der hergestellten Reportergen-Konstrukte wurde mit Hilfe des Dual-Luciferase Reporter Assay System analysiert. Dafür wurden je 20 µl Gesamtzellextrakt in eine 96-Well-Platte gegeben und die Lumineszenz, entstanden durch die enzymatische Aktivität der Luciferasen, am Luminometer gemessen. Während im ersten Messschritt die Firefly-Luciferase durch die Zugabe von 100 µl LARII-Reagenz bestimmt wurde, erfolgte im zweiten Schritt die Analyse der Expression der Renilla-Luciferase durch das Beimengen von 100 µl Stop&Glo-Lösung zur Probe. Die relative Promotoraktivität wurde durch Bildung des Quotienten der beiden gemessenen Luciferasen (Firefly-Luciferase / Renilla-Luciferase) berechnet.

3.2.3.4 SDS-PAGE und Western Blot

Für die Durchführung einer SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) wurden Proben mit SDS-Ladepuffer versetzt und für 5 Minuten bei 95 °C inkubiert. Abhängig von der molekularen Größe des zu untersuchenden Proteins wurden

die Proben auf 10 bis 16%ige Tris-Glycin-Gele aufgetragen und in einer Minigel-Kammer mit SDS-Laufpuffer bei 125 V aufgetrennt. Anschließend wurden die Proteine mittels Tank-Blot-Verfahren mit 400 mA auf eine 0,45 µm Nitrocellulosemembran übertragen. Im folgenden Schritt wurden die auf der Membran gebundenen Proteine mit einer Ponceau-Lösung angefärbt und fixiert. Nach vollständiger Entfärbung der Membran wurden freie Bindungsstellen mit 5% BSA in TBS-T für eine Stunde bei RT abgesättigt. Im Anschluss wurde die Membran dreimal mit TBS gewaschen und mit dem Erstantikörper, verdünnt in 5% BSA in TBS-T, über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach dem Waschen der Membran mit TBS-T sowie TBS wurde diese mit dem Sekundärantikörper, verdünnt in TBS, für eine Stunde bei RT überprobt. Anschließend wurde erneut mit TBS gewaschen und die Proteine durch Inkubation mit SuperSignal West Femto-Substrat im MF-ChemiBIS-Bioimager detektiert.

3.2.3.5 Co-Immunpräzipitation

Um eine Interaktion von C/EBPβ mit Rb zu untersuchen wurden Co-Immunpräzipitationen durchgeführt. Dazu wurden die Zellen durch Serumentzug synchronisiert und nach zweistündiger Serumzugabe Gesamtzellextrakte hergestellt. Für die Präzipitation wurden 100 µl Dynabeads Protein A verwendet. Diese wurden gemäß den Herstellerangaben vorbereitet. Im Anschluss wurden 20 µg Anti-C/EBPβ (C-19) Antikörper, verdünnt in 300 µl PBS für 6 Stunden bei 4 °C an die beads gekoppelt. Als Negativkontrolle wurde eine Präzipitation mit beads ohne Antikörperinkubation durchgeführt. Die beads wurden anschließend mit PBS gewaschen und mit 40 µg Gesamtzellextrakt in 300 µl PBS über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen (zweimal mit PBS-T und einmal mit PBS) wurden die beads mit 20 µl heißem SDS-Puffer resuspendiert und für 10 Minuten bei 70 °C inkubiert. Der Überstand wurde abgenommen und bei -20 °C eingefroren.

3.2.3.6 Chromatin-Immunopräzipitation

Für die Analyse der Bindung von C/EBPβ an die Promotoren mittels Chromatin-Immunopräzipitation (Nelson et al. 2006) wurden 1 x 10⁷ Zellen durch Serumentzug für 90 Stunden synchronisiert und nach zweistündiger Serumzugabe geerntet. Dazu wurden die Zellen bei 365 x g für 10 Minuten bei 4 °C abzentrifugiert und das Pellet in 10 ml kaltem PBS mit 10% FKS resuspendiert. Die Zellen wurden durch

Zugabe von 270 µl Formaldehyd (37%) für 10 Minuten bei RT fixiert. Die Reaktion wurde mit 500 µl Stop-Lösung beendet. Nach zweimaligem Waschen mit kaltem PBS wurde das Pellet in flüssigem Stickstoff eingefroren. Des Weiteren wurden 375 µl Sepharose CL-4B beads mit PBS und Verdünnungspuffer gewaschen sowie mit 10 µl 20%iger BSA-Lösung und 4 µl Glykogen für 2 Stunden bei 4 °C geblockt. Die Zellpellets wurden auf Eis aufgetaut und mit 250 µl L1A (90%

Zellpuffer-Mix; 10% H2O) und 250 µl L1B (90%

Zellpuffer-Mix; 10% NP-40) resuspendiert. Der Ansatz wurde mit 700 x g bei RT abzentrifugiert und die Zellkerne mit 400 µl Kernlyse-Puffer resuspendiert. Die Suspension wurde fünfmal für 15 Sekunden bei 40% Leistung sonifiziert und anschließend abzentrifugiert. Als Input wurden 4 µl des Überstands zurückgestellt. Um die Sonifizierung des Chromatins zu überprüfen wurden 30 µl Lysat mit Hilfe des QIAquick PCR Purification Kits gereinigt und die DNA mit einer Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt, wobei die optimale Größe der Chromatinfragmente zwischen 200 und 1000 bp liegen sollte (Abb. 3.2). Das übrige Lysat wurde mit 600 µl Verdünnungspuffer und 250 µl geblockten beads für eine Vorreinigung für 2 Stunden bei 4

°C unter Rotation inkubiert. Im Anschluss wurden die beads durch Zentrifugation abgetrennt und 200 µl des Überstands mit je 2 µg der Antikörper Histon H3, Normal IgG sowie 2 und 5 µg des Antikörpers C/EBPβ (C-19) über Nacht bei 4 °C unter Rotation inkubiert. Anschließend wurden Protein A 4 FastFlow beads wie oben beschrieben geblockt, mit je 35 µl der beads pro Antikörpergemisch versetzt und für 4 Stunden bei 4

°C rotiert. Im Folgenden wurden die beads mit je 400 µl WBI, WBII, WBIII, TE pH 7,5 sowie TE pH 8 gewaschen und das Chromatin mit 200 µl Elutionspuffer eluiert. Das Eluat wurde anschließend mit dem QIAquick PCR Purification Kit aufgereinigt. Im darauf folgenden Schritt wurden die DNA-Fragmente mittels PCR und Primern, die die hypothetischen C/EBPβ-Bindestellen umspannen auf eine Interaktion mit C/EBPβ untersucht.

1 2 3 4 5 SF91 1 2 3 4 5 SF91 C/EBPβ-long C/EBPβ-short

LAP*

LAP

LIP

GAPDH unspezifisch