Die Rolle von C/EBPβ im Zuge der Differenzierung

In einem weiteren Schritt sollte die Funktion von C/EBPβ während der Differenzierung untersucht werden. Die Bestimmung der Differenzierung wurde in dieser Arbeit ausschließlich durch die morphologische Analyse und das Adhäsionsverhalten der Zellen vorgenommen. Wie bereits erwähnt bewirkte eine PMA-Behandlung von THP-1-Zellen eine Hemmung der Proliferation und Zunahme der C/EBPβ-Expression. Gleichzeitig

veränderte sich die Morphologie der monozytären THP-1-Zellen von rund zu flach, spindelförmig und polygonal, was dem charakteristischen Erscheinungsbild von Makrophagen entspricht. Ebenso zeigten die Suspensionszellen eine verstärkte Adhärenz (Gutsch et al. 2011). Weiterhin beeinträchtigte der knock out von C/EBPβ in den Makrophagen die Differenzierungsfähigkeit. Im Vergleich zu den wt-Zellen, die eine Makrophagenform ausbilden konnten, blieben die ko-Zellen rund. Das Adhäsionsverhalten blieb hingegen unverändert, da beide Zelllinien die Fähigkeit besaßen zu adhärieren (Abb. 4.24). Darüber hinaus führte eine Retransfektion von C/EBPβ in die ko-Zellen bei einem Teil der Zellen zu einer spindelförmigen Zellmorphologie (Gutsch et al. 2011). Daher lag die Vermutung nahe, dass C/EBPβ ein bedeutender Faktor bei der Differenzierung von monozytären Zellen darstellt. Allerdings hatte eine stabile Überexpression von LAP* bzw. LIP bei THP-1-Zellen keinen direkten Einfluss auf die Morphologie sowie das Ahäsionsverhalten (Abb. 4.15). Erst eine Stimulierung mit PMA führte in den stabil überexprimierenden Zellen C/EBPβ-long, C/EBPβ-short und SF91 zu der oben beschriebenen typischen Makrophagenmorphologie. Ebenso wie bei unstimulierten Zellen hatte die vermehrte Anwesenheit von C/EBPβ bei PMA-differenzierten Zellen keine Auswirkungen auf die Zellform (Abb. 4.15). Die ursprünglich erwartete Verstärkung der Differenzierung durch LAP* sowie die Verringerung durch LIP bei C/EBPβ-long bzw. C/EBPβ-short fand demnach nicht statt. In vorherigen Studien wurde ebenfalls der Einfluss von C/EBPβ auf die Zelldifferenzierung untersucht. Diese zeigten, dass ein knock out von C/EBPβ in myeloiden Zellen (Akagi et al. 2010), uterinen Epithelzellen (Bagchi et al. 2006), Chondrozyten (Hirata et al. 2009;

Smink und Leutz 2010), Stromalzellen (Mantena et al. 2006), Brustepithelzellen (Robinson et al. 1998; Seagroves et al. 1998), Lungenepithelzellen (Roos et al. 2012) und Adiopozyten (Tanaka et al. 1997; Tang et al. 2003) zu einer erheblichen Inhibierung der Differenzierung führt. Ebenso konnte eine Differenzierung durch die Applikation von verschiedenen differenzierungsinduzierenden Stimuli wie PMA, Vitamin D₃ und ATRA bei gleichzeitiger Hochregulierung von C/EBPβ nachgewiesen werden (Duprez et al. 2003; Ji und Studzinski 2004; Park et al. 2008). Einige Untersuchungen zeigten eine direkte Wirkung von C/EBPβ auf die Differenzierung von B-Zellen anhand der Hochregulierung von Differenzierungsmarkern wie CD19 sowie Mac-1, allerdings ohne Morphologieänderung (Xie et al. 2004). Weiterhin konnte eine Erhöhung von Differenzierungsmarkern wie MMP-13 und Collagen X bei Chondrozyten durch C/EBPβ detektiert werden. Auch hier war eine direkte Veränderung der Morphologie nicht nachweisbar (Hirata et al. 2009). Im Gegensatz dazu konnten andere Studien einen direkten Einfluss auf die Differenzierung und die damit verbundene Morphologieänderung zeigen. Die stabile Überexpression von C/EBPβ in Keratinozyten zum Beispiel führte zu

einem differenzierten Phänotyp mit gleichzeitiger Hochregulierung von Keratin 1 und Keratin 10 (Zhu et al. 1999). Weiterhin zeigten 3T3-L1-Zellen durch Überexpression von C/EBPβ eine differenzierte Form und konnten sich dadurch zu Adipozyten formieren (Yeh et al. 1995; Calkhoven et al. 2000). Ebenfalls konnten Neuro2A-Zellen und 32D-Bcr/Abl-Zellen durch die Überexpression von C/EBPβ verstärkt differenzieren (Cortes-Canteli et al. 2002; Guerzoni et al. 2006). Ein essentieller Einfluss von C/EBPβ auf die Differenzierung von monozytären THP-1-Zellen konnte in dieser Arbeit also nicht nachgewiesen werden, da der Einfluss von C/EBPβ zelltypabhängig zu sein scheint.

Allerdings könnte die Untersuchung von makrophagenspezifischen Markern wie CD11b, CD14 und des Scavengerrezeptors genauere Einblicke in den Differenzierungsstatus ermöglichen. In der Literatur ist beispielsweise eine verstärkte Bildung von CD11b nach C/EBPβ-Überexpression in NB4-Zellen (Zellen der akuten Promyelozytenleukämie)belegt (Zhang et al. 2010). Diese Ergebnisse führten zu der Erkenntnis, dass die Differenzierung der monozytären THP-1-Zellen durch PMA über einen alternativen, nicht nur auf C/EBPβ gerichteten Signalweg ausgelöst wird.

PMA hat, wie schon erwähnt, die Fähigkeit die Differenzierung von monozytären Zellen zu induzieren (Tsuchiya et al. 1982; Schwende et al. 1996; Park et al. 2008). Dabei wird die PKC aktiviert, die den physiologischen Aktivator Diacylglycerol (DAG) nachahmt und verschiedene zelluläre Funktionen, wie die Zelldifferenzierung reguliert (Nishizuka 1992;

Ono et al. 1988). Einige Studien zeigten eine Veränderung der Expression der PKC-Enzyme PKC-α und PKC-β während der Differenzierung bei einer Vielzahl von Zelllinien (Devalia et al. 1992). Weiterhin wird eine Aktivierung von C/EBPα durch verschiedene PKC-Isoformen postuliert, wodurch es zu einer verstärkten Zelldifferenzierung kommen kann (Efimova et al. 2002). Allerdings bewirkte eine PMA-Behandlung bei THP-1 im Zellkern lediglich eine schwache Zunahme der p30-Isoform sowie eine gleich bleibende Expression der p42-Isoform von C/EBPα, während der Proteinlevel von p42 im Cytosol sogar abnahm (Gutsch et al. 2011).

Demzufolge scheint C/EBPα auch hier keine wesentliche Rolle bei der Differenzierung von monozytären Zellen zu spielen.

Eine andere Möglichkeit wäre die Beeinflussung der PMA-induzierten Differenzierung durch die Modulation der Expression des Transkriptionsfaktors PU.1. PU.1 agiert als einer der Hauptfaktoren bei der Differenzierung und Aktivierung von lymphoiden und myeloiden Vorläuferzellen (Celada et al. 1996). Verschiedene Untersuchungen zeigten beispielsweise eine Aktivierung der Phosphorylierung von PU.1 durch die PKC, wodurch es etwa zu einer Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen kommt (Hamdorf et al. 2011; Mazzi et al. 2004; Ikizawa et al. 2001). In unserer Gruppe konnte ebenfalls gezeigt werden, dass eine Stimulierung der THP-1-Zellen mit PMA eine deutliche

Erhöhung der Proteinkonzentration von PU.1 bei gleichzeitiger morphologischer Differenzierung bewirkte (Dissertation Judith Kandemir), während PU.1 in unbehandelten THP-1-Zellen nicht nachgewiesen werden konnte. Weiterhin hat sich gezeigt, dass PU.1 in den C/EBPβ wt-Makrophagen erheblich stärker exprimiert wird als in den ko-Zellen.

Dies weist deutlich auf eine Regulation von PU.1 durch C/EBPβ hin. Vermutlich liegt die Ursache für die fehlende Differenzierung der ko-Makrophagen bei dem defizienten C/EBPβ-Level und der daraus resultierenden Reduzierung von PU.1. Die Tatsache, dass die Retransfizierung der C/EBPβ ko-Makrophagen mit C/EBPβ nur bei 30% der Zellen eine Makrophagenmorphologie hervorbrachte, spricht allerdings gegen die Annahme, dass PU.1 allein für die PMA-induzierte Differenzierung verantwortlich ist (Gutsch et al.

2011). Daher liegt die Vermutung nahe, dass möglicherweise C/EBPβ zusammen mit PU.1 den Prozess der Differenzierung reguliert. Etliche Studien weisen auf eine Kooperation von C/EBPβ und PU.1 bei der Expression von Genen, die für die Differenzierung verantwortlich sind, hin (Yang et al. 2000; Tissieres et al. 2009). Weiterhin wurde gezeigt, dass die Kombination dieser beiden Transkriptionsfaktoren zu einer Makrophagen-Differenzierung führt und an der Aktivierung eines makrophagenspezifischen Enzyms, der Chitotriosidase, beteiligt ist (Feng et al. 2008;

Pham et al. 2007). Um eine Interaktion von C/EBPβ und PU.1 in THP-1-Zellen nachzuweisen, wäre die Durchführung einer Co-Immunpräzipitation nötig. Ebenso müssten Expressionstudien in den C/EBPβ-long- und C/EBPβ-short-Zellen durchgeführt werden um eine Regulierung von PU.1 durch C/EBPβ nachzuweisen. Eine erhöhte Expression von PU.1 in den C/EBPβ-long-Zellen wäre möglich, da bereits gezeigt wurde, dass PU.1 durch C/EBPβ beeinflusst wird und einen entscheidenden Faktor bei der monozytären Differenzierung darstellt (Weigelt et al. 2009). Ebenso könnte die Aktivierung von PU.1 durch die PKC einer der Gründe für die Reduzierung der Proliferation der C/EBPβ ko-Makrophagen nach PMA-Stimulierung sein, da einige Daten zeigen, dass PU.1 die Fähigkeit besitzt die Zellvermehrung zu inhibieren (Oikawa et al. 1999). Hierzu müssten aber weitere Analysen in Bezug auf PU.1 in den C/EBPβ ko- und wt-Zellen folgen.