2.14.1 Rekombinante Proteinexpression in E. coli 2.14.1.1 Anzucht und Induktion von E. coli
Nach erfolgreicher Transformation der Expressionsplasmide (auf Basis von pQE30 (Qiagen)) in E. coli wurde der Stamm zur rekombinanten Produktion des jeweiligen Proteins verwendet. Hierfür wurde eine ÜN-Kultur des Stammes angesetzt (1-2 ml), mit der 50 ml Expressionsmedium inokuliert wurden. Diese Kultur wurde bis zu einer OD600 von etwa 0,45 angezogen. Ein 1 ml-Aliquot wurde von der Kultur abgenommen und bei RT für 5 Min und 6 000 x g zentrifugiert (Überstand wurde verworfen). Zu der Kultur wurden 100 µl 0,5 M IPTG gegeben und für weitere 4 h bei 37 °C inkubiert.
Dann wurde wiederum 1 ml abgenommen und zentrifugiert (s.o.). Der Rest der Kultur wurde ebenfalls komplett zentrifugiert (RT, 10 Min, 4 500 x g).
2.14.1.2 Expressionskontrolle
Die jeweiligen 1 ml-Aliquots vor und nach IPTG-Zugabe wurden jeweils mit 100 µl SDS-PAGE-Probenpuffer (1x) versetzt und für 5 Min im 95 °C heißen Heizblock gekocht. Kurzes Zentrifugieren sorgte dafür, dass Zelltrümmer pelletierten. 30 µl des Überstandes wurden mittels SDS-PAGE kontrolliert. War durch IPTG induzierte Proteinexpression ersichtlich, wurde das Protein aus der Kultur aufgereinigt.
2.14.1.3 Proteinaufreinigung aus (positiver) E.-coli-Kultur
Aus dem Pellet einer knapp 50 ml E.-coli-Kultur wurde das induzierte Protein
aufgereinigt. Hierfür wurden folgende Schritte vollzogen (die Puffer wurden möglichst frisch angesetzt):
Pellet in 20 ml Protein-Produktions-Puffer A (folgend nur noch Puffer A-F) lösen und 2 Tabletten Complete Mini EDTA-free (Protease-Inhibitor-Mix) zufügen und gut vortexen. Inkubation bei 37 °C im Überkopfschüttler (Snijders Scientific) für 2 h
Zentrifugation bei RT und 10 000 x g für 20 Min
PD10-Säule mit Ni-NTA-Agarose füllen (~1 - 2 ml) und vorbereiten:
o Säule mit 25 ml 30 % Ethanol spülen o Säule mit 25 ml A. bidest waschen o Säule mit 25 ml Puffer A äquilibrieren
Überstand aus vorheriger Zentrifugation mit vorbereiteter Ni-NTA-Agarose ÜN bei 4 °C im Überkopfschüttler (s.o.) anlagern lassen
Suspension bei max. 700 x g und RT für 5 Min zentrifugieren
46 pelletierte Ni-NTA-Agarose wieder in PD10-Säule füllen und Sukzessive mit
folgenden Puffern waschen: 15 ml Puffer A, 25 ml Puffer B, 25 ml Puffer C Elution mit 20 ml Puffer E
Entsalzung gegen A. bidest und Volumeneinengung wurde durch Zentrifugation in Vivaspin 20 Säulen (Sartorius) bei 5 400 x g und 17 °C vollzogen (Dauer variierte).
Die Aufreinigung wurde mittels SDS-PAGE kontrolliert.
2.14.2 Rekombinante Proteinexpression in P. pastoris
25 ml BMGY-Medium wurden mit der gewünschten P.-pastoris-Dauerkultur beimpft und bei 30 °C für 16 - 20 h bei 250 - 300 U/Min bis zu einer OD600 von 2 - 6 inkubiert.
Die Kultur wurde bei 3 000 x g und RT für 5 Min zentrifugiert. Das Pellet wurde in einem solchen Volumen BMMY resuspendiert, dass eine OD600 von 1 erreicht wurde.
Die Kultur wurde für mehrere Tage bei 28 °C und 250 - 300 U/Min inkubiert, wobei täglich Methanol zu einer Endkonzentration von 0,5 % zugefügt wurde. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei RT und 10 000 x g für 20 Min pelletiert. Die im Überstand befindlichen Proteine wurden über Vivaspin 20 Säulen (Sartorius) gewaschen (A. bidest) und konzentriert (Zentrifugation bei 5 400 x g und 17 °C (Dauer variierte)).
2.14.3 Denaturierende Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) Verwendet wurden 12,5 % SDS-Gele. Die in der folgenden Tabelle (s. Tab. 13) angegebenen Komponenten des Trenngels wurden gemischt in die vorbereitete Höfer-Kammer pipettiert und mit 300 µl Isobutanol überschichtet. Nach Erstarren des Trenngels wurde das überschüssige Isobutanol mit A. bidest abgespült. Im Anschluss wurde das Sammelgel gegossen.
2.14.3.1 Aufpolymerisieren des Sammelgels
Die Polyacrylamidkonzentration in den verwendeten SDS-Sammelgelen betrug 5 %.
Ebenfalls in der folgenden Tabelle sind die verwendeten Volumina zu entnehmen.
Nach Erstarren des Trenngels und Entfernung des Isobutanols wurde das gemischte Sammelgel darauf pipettiert und mit Gel-Kämmen versehen. Nachdem diese Schicht auspolymerisierte, wurden die Gele aus der Höfer-Kammer entfernt und feucht bei 4 - 8°C bis zur Verwendung jedoch nicht länger als 1 bis 2 Wochen gelagert.
Tabelle 13: SDS-Gel-Rezepte
SDS-Trenngel 12,5 % SDS-Sammelgel 5 %
40 % Bisacrylamid 4,7 ml 500 µl
SDS-Trenngelpuffer 5,65 ml -
SDS-Sammelgelpuffer - 500 µl
A. bidest 4,4 ml 2,9 ml
10 % SDS 150 µl 40 µl
1 % Bromphenolblau 37,5 µl 40 µl
47
10 % APS 127,5 µl 10 µl
Temed 15 µl 2,5 µl
2.14.3.2 SDS-PAGE
Die zu analysierenden Proben wurden direkt vor der Elektrophorese 1:1 mit SDS-PAGE-Probenpuffer gemischt und für 5 Min bei 95 °C erhitzt. Die Elektrophorese fand in einer mit SDS-PAGE-Laufpuffer gefluteten Kammer bei 120 V (etwa 25 mA) für 45 Min statt. Im Anschluss wurde das Gel in SDS-PAGE-Färbelösung für 30 bis 60 Min gefärbt und danach bis zur gewünschten Intensität wieder entfärbt (s.
Lösungen 2.7).
2.14.4 Aufarbeitung von A.-fumigatus-Gesamtzellprotein
Die Konidien einer mit Aspergillus fumigatus dicht bewachsenen Sabouraud-Platte wurden mit 10 ml MM abgeschwemmt und in 250 ml MM überführt. Dieses wurde ÜN bei 30 °C und 80 - 100 U/Min inkubiert. Die gewachsene Kultur wurde filtriert und mit Na-Citrat-Puffer gewaschen. Die gewaschene Kultur wurde in 3 ml
Protein-Extraktionspuffer suspendiert. 1:1 mit sterilen glass beads (500 µm Durchmesser) gemischt wurde diese Mischung in je etwa 1 ml Volumen im fast prep (Thermo Scientific) in 10 Intervallen der Stärke 6,5 für je 20 s zermahlen; zwischen den Intervallen wurden die Proben auf Eis gekühlt. Es folgte ein Zentrifugationsschritt für 15 Min bei 4 °C und 10 000 x g. Der Überstand wurde danach erneut bei 4 °C und 100 000 x g für 1 h zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und aliquotiert bei -20 °C gelagert.
2.14.5 Aufarbeitung von Membran-assoziierten Proteinen aus A. fumigatus Die Konidien einer mit Aspergillus fumigatus dicht bewachsenen Sabouraud-Platte wurden mit 10 ml MM abgeschwemmt und in 250 ml MM überführt. Dieses wurde ÜN bei 30 °C und 80-100 U/Min inkubiert. Die gewachsene Kultur wurde abfiltriert und mit Na-Citrat-Puffer gewaschen. Die gewaschene Kultur wurde in 3 ml
Protein-Extraktionspuffer suspendiert. 1:1 mit sterilen glass beads (500 µm Durchmesser) gemischt wurde diese Mischung in je etwa 1 ml Volumen im fast prep (Thermo Scientific) in 10 Intervallen der Stärke 6,5 für je 20 s zermahlen; zwischen den Intervallen wurden die Proben auf Eis gekühlt. Es folgte ein Zentrifugationsschritt für 10 Min bei 4 °C und 4 000 x g. Die Überstände wurden erneut bei 4 °C und 36 000 x g für 1 h zentrifugiert. Die pelletierten Membranen wurden je behandeltem Klon in 300 µl Extraktionspuffer aufgenommen.
20 bis 40 µl dieses Extraktes wurden mit 1 ml Extraktionspuffer + 0,2 % Triton X114 gemischt und 1 h bei 4 °C inkubiert. Im Anschluss erfolgte ein 1 minütiges Wasserbad bei 37 °C. Dann wurde 5 Min bei RT und 7 500 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde weitere 2 bis 3 Mal mit 0,2 % Triton X114 versetzt, bei 37 °C inkubiert und
48 zentrifugiert. Das Pellet wurde weitere 2 bis 3 mal mit je 2 - 300 µl Extraktionspuffer versetzt, ebenfalls bei 37 °C inkubiert und zentrifugiert. Die Überstände und Pellets wurden jeweils gepoolt und mit 5 %TCA versetzt, 10 Min auf Eis inkubiert und 10 Min bei RT und 16 000 x g zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen. Auf die
Pellets wurden 2 - 300 µl eiskaltes Aceton pipettiert und nicht gemischt. Es folgte eine Zentrifugation wie direkt zuvor (s.o.), nach der das Aceton abpipettiert wurde und Reste abdampften (5 - 10 Min bei RT). Die Pellets wurden in 20 µl 1x SDS-PAGE-Probenpuffer aufgenommen.
2.14.6 Western Blot
Die zu analysierende Probe musste zunächst auf einer SDS-PAGE aufgetrennt werden (s. 2.14.3.2). Geblottet wurde auf Nitrozellulosemembranen der Firma Schleicher&Schüll (Protran 0,2 µm). Diese Membran wurde zunächst 5 Min in
A. bidest und anschließend 5 Min in Transfer-Puffer äquilibriert. Das SDS-PAGE-Gel wurde ebenfalls in Transferpuffer äquilibriert (5 Min). In einer Blotkammer der Firma Höfer wurde für 2 - 4 h bei 100-150 V unter ständiger Kühlung des Transfer-Puffers die Übertragung durchgeführt. Die Membran wurde danach getrocknet und mit Blockpuffer für 2 h bei RT oder ÜN bei 4 °C gewaschen. Es folgte zweimaliges
Waschen in PBS + 0,1 %Tween20 für jeweils 5 Min bei RT. Der erste Antikörper (z. B.
Rabbit-Anti-A.-fumigatus-ADAM-A) wurde in Blockpuffer verdünnt (1:2 000) mit der Membran für 1 bis 18 h bei RT inkubiert. Im Anschluss wurde viermalig in
PBS + 0,1 %Tween20 für jeweils 5 Min bei RT gewaschen. Der zweite Antikörper (z. B. Monoclonal Anti-Rabbit Immunoglobulins Clone RG-16) wurde in Blockpuffer verdünnt (1:10 000) für 1 h bei RT inkubiert, dreimalig mit PBS + 0,1 %Tween20 für jeweils 5 Min bei RT und einmal ohne Tween20 gewaschen.
2.14.7 Detektion Peroxidase (POD)-gekoppelter Antikörper
Die zu behandelnde und mit PBS gewaschene Membran (aus Southern- oder Western-Blot) wurde mit 0,125 ml je cm² mit einer 1:1-Mischung aus den ECL-Reagenzien (Amersham) 1 und 2 für 1 Min bei RT inkubiert. Es folgte
Exposition/Belichtung des Röntgenfilms in lichtdichter Kassette für 1 bis 30 Min. Der Film wurde 2 Min entwickelt (Kodak), was durch ein Bad in Essigsäure (5 %) gestoppt wurde. Danach wurde der Film für 2 - 5 Min in Fixierer (Kodak) geschwenkt. Im
Anschluss erfolgte Wässern des Films in Leitungswasser und die Trocknung des Films bei RT.
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