4.1.1 Rekombinant hergestellte Proteine
Es ist aus einigen Arbeiten bekannt, dass die Möglichkeit besteht, mit Vakzinen gegen eine invasive Aspergillose durch Erzeugung einer protektiven Immunreaktion vorzubeugen. Bislang wurde mit vier verschiedenen Einzelantigenen in
Tierversuchen Immunität gegen diese Erkrankung erzeugt (Bozza 2002 und 2009; Ito 2006). Als Vorbereitung für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten
84 Tierversuche wurden 38 verschiedene Antigene rekombinant hergestellt (s. Tab. 14 und 15). Die Auswahl der verschiedenen Antigene wurde hierbei auf Basis mehrerer Ergebnisse aus anderen Arbeiten getroffen. In zwei veröffentlichten Studien wurden infektionsrelevante Antigene bestimmt, indem Infektionsseren aus Kaninchen
gewonnen wurden, welche nach einer subletalen Aspergillus-Infektion immun gegen folgende Infektionen geworden waren. Einerseits wurden mit diesen Seren Proteine mittels einer A.-fumigatus-cDNA-Expressionsbank identifiziert (Denikus 2005), andererseits wurden Proteine des zellulären Proteoms dieses Erregers auf
zweidimensionalen SDS-PAGE aufgetrennt, welche daraufhin im Immunoblot mit den Kaninchenseren reagierten. Identifiziert wurden diese Proteine durch Analysen über massenspektrometrische Methoden (Asif 2010). Durch die Verwendung von
Tierseren, die aus gegen A. fumigatus immunen Tieren gewonnen wurden, und deren Bindung an Proteine wird die Wichtigkeit dieser Antigene aus diesen Arbeiten verstärkt.
In einem anderen Projekt wurde das Proteom von Kondienoberflächen untersucht (Asif 2006). Da die Proteine dieser Lokalisation zuerst mit dem infizierten
Organismus in Kontakt kommen sollten, sind diese Proteine ebenfalls wichtige Kandidaten, die es im Rahmen dieser Arbeit zu untersuchen galt.
4.1.2 Immunisierung von Mäusen mit rekombinant hergestellten Proteinen Tierversuche sind bei der Erforschung von Aspergillosen eine unverzichtbare
Methode. Nicht nur können neu entwickelte Medikamente vor klinischen Studien auf ihre Wirksamkeit überprüft werden, es können auch Versuche durchgeführt werden, bei denen klinische Studien am Menschen unangebracht sind, wie es bei der
Erforschung von präventiven Vakzinen der Fall ist. Zusätzlich ist die Variabilität von Versuchen an Tieren ein großer Vorteil. So können verschiedene Stämme des
Erregers getestet werden inklusive im Labor erzeugter Gen-Deletionsmutanten. Auch kann die Art und Weise der Immunsuppression oder der Ort der Infektion geändert werden (Clemons 2006). So kann der Tierversuch der jeweiligen Fragestellung angepasst werden.
Die Abwehr gegen Aspergillus fumigatus in immunkompetenten Individuen verläuft hauptsächlich über die Zellen der angeborenen Immunität (Cenci 2000; Lessing 2007; Segal 2009). Hierbei ist die Funktion von Makrophagen und neutrophilen Granulozyten kaum bestreitbar. Diese sind zum einen als residente
Alveolarmakrophagen Bestandteil der angeborenen Immunität. Andererseits werden diese Zellen im Rahmen der adaptiven Immunabwehr aktiviert. Hierbei sind bei der invasiven Aspergillose besonders die TH1-Lymphozyten mit ihren Zytokinen an der Verstärkung der Abwehrwirkung der Makrophagen beteiligt – sowohl die
Phagozytoserate als auch die Produktion biozider Substanzen werden verstärkt (Martin 2009). Diese T-Zellen werden aktiv, wenn sie einen Antigen präsentierenden Antigen-MHC-II-Komplex erkennen. Die Signalgeber stellen in dem Komplex
enthaltene, kurze Peptide (T-Zell-Epitope) dar. Es ist also nicht nötig, komplette Proteine als Vakzin zu verwenden, weil diese in den präsentierenden Zellen generell zerkleinert werden. In einer Arbeit an Aspergillus fumigatus wurde demonstriert, dass
85 verwendete Bruchstücke von dem Allergen Aspf16 ausreichten, um bei einer
Präsentation auf dendritischen Zellen eine TH1-Zell-Aktivierung auszulösen (Ramadan 2005).
Die verwendeten Versuchstiere wurden in drei Gruppen eingeteilt. Eine der Gruppen stellte eine Negativkontrolle dar, der nur Adjuvans in PBS injiziert wurde. Bei dieser Gruppe wurde nach erfolgter Infektion starkes, invasives Wachstum mit dem Erreger und folgend der Tod erwartet. Die zweite Gruppe diente als Positivkontrolle. Den Mäusen dieser Gruppe wurden die Proteine Aspf3, Aspf16 und Gel1 in PBS zusammen mit dem verwendeten Adjuvans gespritzt; es wurden drei der vier bekannten Antigene verwendet, die laut bisheriger Veröffentlichungen Immunität verleihen (Bozza 2002 und 2009, Ito 2006). Erwartet wurde, dass diese Tiere vor der folgenden Infektion mit Aspergillus-fumigatus-Konidien geschützt waren, und dass sie deswegen überleben. In der dritten Gruppe wurde eine Kohorte von sechs der hergestellten Proteine in PBS mit dem Adjuvans AS03 als zu testendes Vakzin appliziert. In dieser Gruppe hätte ein Überleben der Tiere die Ausbildung einer protektiven Immunreaktion gezeigt, ein Sterben, dass dies nicht geschah. Da jedoch in allen Versuchstiergruppen in etwa die gleiche Anzahl an Tieren starben, kann keine definitive Aussage getroffen werden.
Durch den Tod der Tiere und der Kontrolle auf invasives Wachstum durch Aspergillus fumigatus wurde deutlich, dass eine Immunsuppression und die folgende Infektion stattgefunden hatten. Die erwünschte Immunität innerhalb der Positiv- und der Vakzingruppe konnte jedoch nicht erzeugt werden. Hierbei lassen sich mehrere Vermutungen aufstellen, wo mit Verbesserungen anzusetzen sein könnte. Zum einen ist zu vermuten, dass durch die verwendete, starke Immunsuppression die Zellen des Immunsystems so stark in ihrer Funktion gehindert wurden, dass deswegen keine TH1-Immunantwort aktiviert werden konnte, woraufhin es ebenfalls nicht zur
Ausbildung einer protektiven Immunreaktion kam. Vergleichsweise nutzte Ito (2006) sechs Dosen à 2,5 mg je Maus (15 mg Cortisonacetat gesamt), während in dieser Arbeit dreimal 7,5 mg s.c. gespritzt wurden (22,5 mg gesamt). Dementsprechend könnte eine etwas schwächere Suppression sinnvoll sein.
Zum anderen ist die Infektionsdosis an Konidien, mit denen die Tiere infiziert wurden, variabel; wobei diese noch unter der von Bozza (2002 und 2009) verwendeten Dosis lag (2 x 107 Konidien pro Maus). In der Arbeit von Ito (2006) wurden hingegen mit 3 x 106 Konidien pro Maus weniger Sporen verwendet. Es könnte also hilfreich sein eine etwas niedrigere Dosierung zu wählen. In diesem Rahmen muss auch beachtet werden, dass die in verschiedenen Arbeiten verwendeten Stämme von Aspergillus fumigatus unterschiedlich virulent sind (persönliche Mitteilung von Utz Reichard).
Fraglich ist auch, ob das verwendete Adjuvans AS03 in diesem Versuchsrahmen wirksam ist. Klar von Vorteil für weitere Ansätze ist, dass es bereits für die
Verwendung bei humanen Impfungen zugelassen ist. Durch den ähnlichen Aufbau der Komponenten zu denen des bei Ito (2006) verwendeten Adjuvans TiterMax, sollte auch hier eine ähnliche Wirkung erzielt werden. Dies wird durch den Fakt
86 unterstützt, dass der Bestandteil Squalen beider Adjuvantien im Rahmen einer T-Zell-Aktivierung mitwirken kann (Carlson 2000).
Als positiver Ergebnisteil ist hervorzuheben, dass die beiden einzigen Mäuse, in denen überhaupt kein invasives Wachstum mit Aspergillus fumigatus stattgefunden hatte, zu den Gruppen der Positivkontrolle und der Vakzingruppe gehörten. Dies ist ein positiver Anhaltspunkt, den es auszubauen gilt.