Protein-Blast mit RoxA

Eine anfänglich vermutete Hitzeinstabilität des mutierten RoxA scheint auf die Gesamtheit zuzutreffen, weniger jedoch auf das gewünschte, korrekt gefaltete W302L-Protein, das sich isolieren ließ. Ein geringer, kaum signifikanter Aktivitätsverlust wurde bei der Mutante im Aktivitätstest bei 45°C festgestellt, der bei den Wt-Präparationen nicht zu sehen war (Abb.

3.27 b).

Jüngst konnte nach erneuter Isolierung von RoxA-W302L gezeigt werden, dass bei schrittweiser anaerober Reduktion (Na⁺-Dithionit) dieser mutierten Enzymvariante, deren zwischen den Häm-Propionatgruppen lokalisierte aromatische Aminosäure Trp302

ausgetauscht worden war, die Zunahme des zweiten Maximums der α-Bande bei 553 nm erst mit deutlicher Verzögerung im Vergleich zu Wt-RoxA zunahm. Umgekehrt blieben im Zuge der Reoxidation mit Ferricyanid die beiden Signale bei 549 nm und 553 nm in etwa gleicher Ausprägung bis fast zur vollständigen Oxidation bestehen (unveröffentlichte Beobachtung N.

Hambsch), wobei Reduktion und Reoxidation bei Wt-RoxA etwa in gleicher Weise verlaufen (s. Kap. 3.9.1). Dies kann als Hinweis auf eine direkte Beteiligung von Trp302 an der Elektronenverschiebung zwischen den Hämzentren verstanden werden, wie es in analoger Weise für Tryptophane an gleicher Position in bakteriellen Cytochrom c Peroxidasen vermutet wurde (de Smet et al., 2006). Wie an diesem Beispiel offensichtlich wird, kann der Vergleich zu Proteinen mit gewisser Ähnlichkeit in Sequenz bzw. Struktur eine wertvolle Hilfestellung zur Entschlüsselung des Wirkungsmechanismus von RoxA leisten. Es wurde daher die Proteindatenbank regelmäßig auf Einträge von Proteinen mit Ähnlichkeiten in der Aminosäuresequenz zu RoxA untersucht.

alternatives Startcodon im gleichen Leseraster gefunden. Das sich daraus ergebende, 42 Aminosäuren größere Protein unterscheidet sich von RoxA in der Länge nur durch zwei Aminosäuren und weist nun tatsächlich eine Signalsequenz am N-Terminus auf (SignalP 3.0 Server). Diese besitzt ähnlich wie diejenige von RoxA eine Länge von 29 Aminosäuren, unterscheidet sich aber in der Aminosäure-Zusammensetzung deutlich. Damit sind auch die reifen Proteine in etwa gleich lang. Gleiches gilt auch für Hoch_1441, welches ebenso eine N-terminale Signalsequenz besitzt (Tab. 3.9). In beiden Fällen scheint es sich um saure Proteine zu handeln mit theoretischen pI-Werten für die reifen Proteine von 4,9 und 4,65 im Gegensatz zu RoxA, das einen neutralen physiologischen pI-Wert besitzt (s. Kap. 3.3). Möglicherweise stellt dieser Unterschied eine Anpassung an die jeweiligen unterschiedlichen Lebensbedingungen von Haliangium ochraceum und Xanthomonas sp. 35Y dar.

Tab. 3.9: Gegenüberstellung von RoxA und den beiden in H. ochraceum gefundenen Homologen.

Dieser liegen die Haliangium-Gene unter Einschluss einer Signalsequenz zugrunde, wie sie auch nach Überarbeitung der Datenbankeinträge annotiert wurden, Hoch_1661 und Hoch 1441; aa : Aminosäuren

RoxA Hoch_1661 Hoch_1441

aa-Identität 100 % 63 % 36 %

aa-Ähnlichkeit 100 % 78 % 51 %

Länge [aa] 678 676 678

sigPep [aa] 30 29 25

[aa] (mature) 648 647 653

Größe [kDa]^* 71,52 72,17 71,31

pI (theoret.)^* 7,3 4,9 4,65

^* Kalkulation mit http://expasy.org/tools/pi_tool.html

Abb. 3.28 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen beider Proteine mit RoxA. Dabei wird neben einer insgesamt hohen Übereinstimmung von Hoch_1661 mit RoxA eine hohe Homologie zwischen allen drei Proteinen in bestimmten Regionen offensichtlich. Dies sind zum einen die beiden Hämbindemotive, insbesondere die des C-terminalen Häms, zum anderen die ebenso bei bakteriellen Peroxidasen und MauG-Proteinen konservierte Region um His517. Auch aromatische Aminosäuren erscheinen häufig konserviert, beispielsweise zwei aufeinander folgende Trp-Reste an Position 291 und um Trp302 (s. Abb. 3.28), welchem eine Beteiligung am Elektronentransport zwischen den Hämzentren zugeschrieben wird (s.

Kap. 4.2.5). Im Zuge der Ähnlichkeit zu RoxA überrascht es nicht, dass beide reifen Proteine einen ebenso relativ hohen Anteil an Aromaten aufweisen, 12,6 % in Hoch_1661 (35 Phe: 5,4

%, 17 Trp: 2,6 %, 30 Tyr: 4,6 %) und 10,7 % in Hoch_1446 (29 Phe: 4,6 %, 21 Trp: 3,2 %, 19 Tyr: 2,9 %) verglichen mit 11,4 % in reifem RoxA (24 Phe: 3,7 %, 21 Trp: 3,1 %, 30 Tyr:

4,6 %) (vgl. Tab. 4.2, Kap. 4.11.1). Zudem findet sich hohe Übereinstimmung an Positionen

Übereinstimmung weist der N-Terminus und damit die Signalsequenzen auf, dagegen ist der C-Terminus konserviert.

Abb. 3.28: Alignment der Aminosäuresequenzen von RoxA, Hoch_1661 und Hoch_1446. Die vorgeschlagenen N-terminalen Signalsequenzen sind unterstrichen, die Hämbindemotive rot umrandet, die konservierte Region um H517 schwarz umrandet, konservierte aromatische Aminosäuren um Position 291 und 301 grün umrandet. * = hohe, : = mittlere, . = geringe, ohne = keine Übereinstimmung. Das Alignment wurde erstellt mit GENtle Vers. 1.9.4.

Betrachtet man die sequenzierte Region um Hoch_1661, findet man weitere Ähnlichkeiten zur Region um RoxA in Xanthomonas, von welcher jedoch bislang lediglich 7,6 kb bekannt sind (vgl. Braaz, 2005 b, Abb. 2.5.1). Es findet sich weiter upstream das Gen für eine Acetyl-CoA-Acetyltransferase, wie auch in der RoxA-Region, doch weisen beide Gene keine

Sequenzähnlichkeit auf. Desweiteren wurden in Übereinstimmung zur RoxA-Region Gene für eine Aminoglycosid-Phosphotransferase (55 % Identität zu Xanthomonas sp. 35Y) und eine Enoyl-CoA-Hydratase/Carnithin-Racemase (56 % Identität zu Xanthomonas sp. 35Y) gefunden. Diese beiden besitzen dagegen hohe Übereinstimmung zu den um RoxA kodierten Proteinen, in diesem Fall sogar eine höhere als mit allen anderen Datenbankeinträgen (Stand 07. 2011). Die Anordnung der Gene ist allerdings sehr unterschiedlich (Abb. 3.29, vgl. Abb.

2.5.1 in Braaz, 2005 b). Darüber hinaus sind in diesem Bereich des Haliangium-Genoms weitere, an der β-Oxidation beteiligte Gene lokalisiert (s. Abb. 3.29).

Sehr unterschiedlich ist die Region um das zweite potentielle RoxA-Homolog Hoch_1446 organisiert. Es finden sich keine Gene für Enzyme der β-Oxidation oder ähnlicher Abbauwege – mit einer Ausnahme: Direkt im Anschluss an Hoch_1446 befindet sich in gleicher Leserichtung das Gen für eine Aldo-/Keto-Reduktase (Hoch_1447), die eine ähnliche Funktion wie das im Anschluss an lcp in Streptomyces sp. K30 entsprechend lokalisierte Gen der oxiAB-Oxidoreduktase (Rose et al., 2005 b) erfüllen könnte (s. Kap. 4.13).

Abb. 3.29: DNA-Region im Genom von Haliangium ochraceum um das kodierende Gen Hoch_1661 des zu RoxA ähnlichen Proteins. Hoch_1661 ist rot umrandet, orange umrandet sind drei Gene mit den gleichen Funktionen der jeweiligen Proteine wie sie downstream von roxA im Xanthomonas-Genom in entgegengesetzter Leserichtung gefunden wurden (vgl. Braaz, 2005 b, Abb. 2.5.1).

Es wurden bisher folgende Proteinfunktion zugewiesen:

Hoch_1652: Short-Chain Dehydrogenase/Reduktase Hoch_1653: Aminoglycosid-Phosphotransferase Hoch_1654: Acyl-CoA-Dehydrogenase-Domäne-Protein Hoch_1655: Enoyl-CoA Hydratase/ Isomerase

Hoch_1656: TetR-family Transkriptions-Regulator Hoch_1657: Acetyl-CoA Acetyltransferase

Hoch_1658: 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase NAD-Bindeprotein Hoch_1659: Acyl-CoA-Dehydrogenase -Domäne-Protein

Hoch_1660: 3-Hydroxyacyl-CoA Dehydrogenase NAD-Bindeprotein Hoch_1661: Hypothetisches Protein

Hoch_1662: Acyl-CoA-Dehydrogenase -Domäne-Protein Hoch_1663: Acyl-CoA-Dehydrogenase -Domäne-Protein

Hoch_1664: Alkohol-Dehydrogenase Zink-Bindedomäne-Protein Hoch_1665: Hypothetisches Protein

Hoch_1666: AMP-abhängige Synthetase und Ligase

halotoleranten Myxococcus fulvus HW-1 (Li et al., 2011) ebenfalls ein Gen mit einer vergleichbar hohen Übereinstimmung zu RoxA wie Hoch_1661 aus H. ochraceum gefunden, das für das hypothetische Protein LILAB_11505 (Gene-ID: 10876757) mit etwa 78 % Ähnlichkeit zu RoxA kodiert, dem in der vorläufigen Annotierung aber keine Signalsequenz zugewiesen wurde. Es findet sich jedoch weiter upstream im gleichen Leseraster ein alternatives Startcodon unter dessen Annahme sich für das Protein eine Länge von 2025 bp ergibt und mit höchster Wahrscheinlichkeit ein Signalpeptid von 26 aa findet, nach dessen Abspaltung sich für das reife Protein wie RoxA 648 aa ergeben (vgl. Tab. 3.9). Auch dieses besitzt mit 11,6 % einen hohen Anteil an aromatischen Resten (32 Phe: 4,9 %, Trp: 2,5 %, 24 Tyr: 4,2 %). Downstream von LILAB_11505 befinden sich im M. fulvus -Chromosom in gleicher Leserichtung ebenfalls alle wichtigen, an der β-Oxidation beteiligten Gene.

Ferner zeigten sich auch auffallende Übereinstimmungen der Aminosäuresequenz bis zu einem E-Wert von 10^-39 mit Proteinen unbekannter Funktion aus weiteren Bakterien unterschiedlicher Gattungen. Die besten Treffer wurden bei einigen Planktomyceten gefunden, einer einzigartigen Gruppe unter den Bakterien, welche von zellinternen Membranen umschlossene kernähnliche Strukturen besitzen, sowie eine ausschließlich aus Proteinen bestehende Zellwand. Mit abnehmender Ähnlichkeit sind dabei hypothetische Proteine aus Isosphaera pallida sp. IS1B^T (Göker et al., 2011), Planctomyces brasiliensis DSM 5305, Gemmata obscuriglobus UQM 2246, Planctomyces limnophilus DSM 3776, Pirellula staleyi DSM 6068, Planctomyces maris DSM 8797, Rhodospirellula baltica WH47, Nitrosococcus oceani AFC27 und ATCC 19707, Blastospirellula marina DSM 3645, Rhodopirellula baltica SH 1, und andere zu nennen, von welchen einige ebenfalls ein N-terminales Signalpeptid aufweisen. Es offenbarte sich bei diesen eine Ähnlichkeit von maximal etwa 39 %. Auffallend waren Ähnlichkeiten im Bereich der in Cytochrom c Peroxidasen konservierten "MauG"-Region um einen Histidin-Rest (His517 in RoxA), sowie das Vorhandensein zweier Häm-Bindemotive und das gleiche C-terminale Ende.

3.8.2 Kultivierung des Myxobakteriums Haliangium ochraceum DSM 14365