Induktion von RoxA mit Polyisopren-Spaltprodukten

Häufig wird der Abbau von extrazellulären Substraten durch spezielle Spaltprodukte initiiert, die als Induktor fungieren. Um Hinweise auf eine Beteiligung von durch RoxA produzierten Kautschuk-Abbauprodukten oder möglicherweise eine Beteiligung des Polymers selbst zu erhalten, wurden entsprechend der Vorgehensweise im RoxA-Aktivitätstest extrahierte Latex-Spaltprodukte als Induktor getestet. Diese wurden in geringer Konzentration (200 µ M) zu Latex-freiem Minimalmedium mit 0,2 % Gluconat gegeben und Xanthomonas-Kulturen auf eine mögliche RoxA-Expression im Vergleich zu Kontrollansätzen ohne Spaltprodukte über

der Latex-Spaltprodukte nach 24 Stunden ein schwaches Signal bei 407 nm im UV-Vis-Spektrum im Vergleich zur Negativkontrolle sichtbar, welches jedoch nach längerer Inkubation nicht weiter zunahm. Nach SDS-PAGE war mit Silberfärbung eine zusätzliche Bande auf Höhe von RoxA zu sehen, der zudem ein Häm-Signal zuzuordnen war (Abb. 3.18).

Auch der Aktivitätstest zeigte eine Latex spaltende Wirkung an. In Übereinstimmung mit der Hemmung der RoxA-Expression in Vollmedien trotz Anwesenheit von Latex, wurde auch eine Induktion durch isoliertes ODTD nur in Minimalmedien, nicht in LB-oder NB gefunden.

Somit lieferten diese Versuche Hinweise auf eine Induktion der RoxA-Expression durch Latex-Spaltprodukte, wahrscheinlich in erster Linie durch ODTD, das darunter den Hauptanteil ausmacht. Dass dieses als Latex-Abbauprodukt Xanthomonas als C-Quelle dient, also zur Energiegewinnung weiter verstoffwechselt wird, könnte die fehlende Zunahme der RoxA-Produktion bei längerer Inkubation aufgrund schnellen Verbrauchs erklären. Befindet sich dagegen Latex im Kulturmedium kann ODTD durch RoxA vermittelte Spaltung nachgeliefert werden. Die Anwesenheit von Latex alleine liefert erst nach etwa 4–5 Tagen eine sichtbare RoxA-Expression. Wurde ODTD allerdings in einer hohen Konzentration (z. B.

5 mM) eingesetzt, so führte dies zu einem Wachstumsstopp bzw. einem Absterben der Xanthomonas-Zellen vermutlich durch toxische Wirkung der Aldehydgruppen.

Abb. 3.18: SDS-Gel: (links) Silberfärbung, (rechts) spezifische Hämfärbung: Unkonzentrierter Xanthomonas-Kulturüberstand nach Zugabe mit durch RoxA generierten Latex-Spaltprodukten:

M: Marker; K: Kontrolle nicht induzierter Kulturüberstand; + ODTD: nach Zusatz von extrahierten Latex-Spaltprodukten nach einem (1 d) und 2 Tagen (2 d). Die ODTD-induzierten Kulturen zeigen eine RoxA-Bande im Kulturüberstand, sowohl im Silbergel als auch mit Hämfärbung (Pfeil).

Nachdem diese Beobachtungen gezeigt hatten, dass RoxA-Spaltungsprodukte bei der Induktion des Enzyms eine Rolle spielten, wurden weitere Substanzen mit gewisser Ähnlichkeit zum Hauptspaltprodukt ODTD, beispielsweise in Form von Aldehyd-, Ketogruppen oder Methylresten aufwiesen, getestet. Mit keiner dieser Verbindungen, u. a. β-Carotin, Squalen, Pristan (Tetramethylpentadecan), Citronellal, Geraniol, Glutaraldehyd, Hexaldehyd, Butanon, Isobutanal, Propanal, Isobutylmethylketon und 6-Methyl-5-Hepten-2-on (100 µ M – 1 mM), wurde weder im UV-Vis-Spektrum, noch nach SDS-PAGE ein Hinweis auf eine Induktion der RoxA-Expression gefunden. Die Interpretation dieser negativen Befunde wird jedoch erschwert durch die Verwendung einiger flüchtiger Verbindungen bzw. der schlechten Löslichkeit von Substratanaloga. Insbesondere Aldehyde führten aufgrund ihrer toxischen Wirkung zu vermindertem Wachstum von Xanthomonas sp..

Das Testen geringerer Konzentrationen sollte diese Unsicherheit ausräumen können.

Weitere Versuchsreihen befassten sich mit der Induktion durch unspezifisch gespaltene Polyisopren-Bruchstücke. Von Enoki et al., wurde eine oxidative Spaltung von cis- und trans-1,4-Polyisoprenen durch verschiedene Systeme beschrieben, in denen Metall-Enzyme aus bestimmten Mediatoren Radikale generieren, welche bei Anwesenheit von O2 die Polymerspaltung herbei führen (Enoki et al., 2003). Die so entstehenden Spaltprodukte ähnelten, abgesehen von ihrer variablen Größe, dem Hauptprodukt der RoxA-generierten Latexspaltung ODTD, mit Aldehyd- bzw. Ketogruppen. Die Wirksamkeit solcher unspezifischen Latex-Zerfallsprodukte aus drei Enzym-Mediator-Systemen auf eine Induktion von RoxA wurde untersucht. Kautschuk-Latex wurde mit Lipoxygenase/Linolsäure bzw.

Fenton-Reagenz/Linolsäure bzw. Meerrettich-Peroxidase (HRP)/1-Hydroxybenzotriazol (HBT) in der von Enoki et al., dokumentierten Weise inkubiert und nach Ethylacetat-Extraktion mit HPLC analysiert. In allen drei Systemen konnte man im Vergleich mit Negativkontrollen starke Veränderungen erkennen, die auf eine Zersetzung des Polymers hinwiesen. Daraufhin wurden Induktionsversuche in der bereits beschriebenen Weise durchgeführt. Doch aus keinem der drei Systeme extrahierte Spaltprodukte konnten eine RoxA-Expression induzieren. Gleichzeitig schließen diese Befunde aus, dass die festgestellte Induktion durch auf dem gleichen Wege wie RoxA-generierte Latex-Spaltprodukte extrahierte mögliche Reste des Polymers zurückgehen könnte. Die RoxA-Expression schien spezifisch auf ODTD bzw. geringfügig unterschiedliche Spaltprodukte anzusprechen. In diesem Zusammenhang sei erwähnt, dass ein Polymerstrang eine bestimmte Mindestzahl an Isopreneinheiten aufweisen muss, um von RoxA gespalten zu werden. Gereinigtes ODTD mit zwei vollständigen Einheiten ließ sich durch RoxA nicht weiter spalten. Da Spaltprodukte mit bis zu fünf vollständigen Isopreneinheiten nachgewiesen werden konnten (Braaz et al., 2004), müsste diese Länge mindestens sieben Einheiten betragen.

Nachdem die spezifische Induktion von RoxA durch Latex-Spaltprodukte wie ODTD gezeigt werden konnte, bot sich auch die Perspektive, dieses statt Latexmilch zur RoxA-Produktion bei Kultivierungen einzusetzen. Zur Abhängigkeit der Produktion an Latex-Spaltprodukten von der Konzentration an Enzym bzw. Substrat, sowie der Inkubationszeit wurden verschiedene Versuchsreihen durchgeführt. Diese sollen anhand der über die Zeit untersuchten ODTD-Produktion bei konstanter Latexkonzentration von 0,5 % bzw. 5 % und variierenden RoxA-Konzentrationen veranschaulicht werden. Ziel dieser Versuche war neben der Gewinnung weiterer Informationen zur Enzymkinetik der Latexspaltung durch RoxA auch die Ergründung optimaler Bedingungen zur Herstellung des Hauptspaltproduktes ODTD bezüglich einzusetzender Substrat- und Enzymmenge.

Die Inkubation von RoxA mit Kautschuklatex und die anschließende Extraktion und Detektion des Spaltproduktes ODTD erfolgte in analoger Weise zum RoxA-Aktivitätstest (Kap. 2.7.1). Es wurden Batch-Ansätze mit definierter Latex-Konzentration und jeweils unterschiedlichen Mengen an gereinigtem RoxA zwischen 0,4 µg/ml und 200 µg/ml bei 0,5 % Latex bzw. 1 mg/ml bei 5 % Latex für drei Tage bei 40°C inkubiert und die Generierung des Spaltproduktes ODTD mittels HPLC über die zugehörigen Peakflächen zu verschiedenen Zeitpunkten verglichen.

In Abb. 3.19 ist die ODTD-Produktion in Abhängigkeit der eingesetzten RoxA-Konzentration zu verschiedenen Zeitpunkten dargestellt. Die Graphen, die sich nach 24, 48 bzw. 72 Stunden ergaben, entsprachen sich in ihrem Verlauf. Ein Großteil des insgesamt produzierten ODTD lag bereits nach 24 Stunden bei 40°C vor, steigerte sich noch bis 48 Stunden, danach nicht mehr nennenswert. Betrachtet man nur die absoluten Werte ab 24 Stunden, ergaben sich mit höherer Substrat-Konzentration auch insgesamt höhere ODTD-Mengen. Dies gilt jedoch nur für RoxA-Konzentrationen im Sättigungsbereich, der sich mit 0,5 % Latex bei 40–100 µg RoxA/ml, mit 5 % Latex bei 200–400 µg RoxA/ml einstellte (Abb. 3.19, 24 h, 48 h). Mit geringeren Enzymkonzentrationen wurde mit niedrigerer Latexkonzentration stets auffallend mehr Spaltprodukt erhalten. Dies gilt insbesondere für die Menge an ODTD nach drei Stunden, die bei allen getesteten Enzymkonzentrationen deutlich höher lag als bei vergleichbaren RoxA-Konzentrationen mit 5 % Latex (Abb. 3.19, 3 h). Es zeigte sich zudem, dass die ODTD-Menge bei 0,5 % Latex nach drei Stunden bereits einen erheblichen Anteil der Menge nach 24 bzw. 48 Stunden ausmachte, die Zunahme sich also nicht bzw. ab einem gewissen Zeitpunkt nicht mehr zeitlich linear verhielt, sondern die geringere Substratmenge verhältnismäßig schneller umgesetzt wurde als eine hohe Substratmenge. Dagegen stiegen mit hoher Latex-Konzentration (5 %) die ODTD-Ausbeuten bei einer Inkubation von 24 Stunden und länger im Vergleich zu 3 Stunden deutlich an, was sich mit der fehlenden Limitierung durch das ausreichend vorhandene Substrat begründen

lässt. Dies erklärt jedoch nicht, warum die ODTD-Menge bei sehr niedrigen RoxA-Konzentrationen noch weit unter denen der entsprechenden Ansätze mit niedriger Latexmenge lag. Erst ab einer RoxA-Menge von ca. 100 µ g/ml wurde mit 5 % Substrat auch mehr Spaltprodukt erhalten als mit 0,5 %. Demnach kommt offensichtlich dem relativen Verhältnis der eingesetzten Enzymmenge zur Substratmenge eine entscheidende Bedeutung zu. Betrachtet man die ODTD-Ausbeuten in Bezug zu diesem Verhältnis, sind die Unterschiede zwischen den Versuchsreihen bei 0,5 % und der zehnfachen Latexkonzentration nicht mehr ganz so deutlich.

Abb. 3.19: ODTD-Produktion (relative Peakflächen) in Abhängigkeit der RoxA-Konzentration bei 0,5

% (rot) und 5 % Latex (blau) im Vergleich nach 3 h, 24 h und 48 h. Die ODTD-Menge nach 3 h war mit 0,5 % Latex mit jeder Enzymkonzentration deutlich höher als mit 5 % Latex. Bei längerer Inkubation überstieg die absolute ODTD-Menge bei 5 % Latex erst ab einer RoxA-Konzentration von ca. 100 µ g/ml diejenige bei 0,5 % Latex. Bei beiden Latexkonzentrationen war oberhalb einer jeweils unterschiedlichen Enzymkonzentration eine deutlich verminderter Produktzuwachs zu erkennen (s.

Text).

In Ansätzen mit 5 % Latex stieg bis ca. 200 µg RoxA/ml die generierte ODTD-Menge stark an, mit größeren Enzymmengen war der Zugewinn nur noch unverhältnismäßig gering.

Demnach wurde mit 5 % Latex beginnend ab ca. 200 µg/ml annähernd ein Plateau erreicht, bei 0,5 % Latex bereits ab 40 µg/ml auf etwa einem Drittel des Wertes. Mit Blick auf die Ausbildung dieses Endpunktes der ODTD-Produktion, ließ sich feststellen, dass dieser Wert mit 5 % Latex bei etwa der Hälfte der RoxA-Menge im Verhältnis zur Latexmenge erreicht wurde als bei 0,5 % Latex. Daraus lässt sich auf eine Substratsättigung bei 5 % Latex schließen, die aber wahrscheinlich schon bei niedrigerer Konzentration (1–2 %) eintritt.

Betrachtet man aber die absoluten Werte, war zum Erreichen der somit etwa dreifachen

0 100 200 300 400 500 800 900 1000

0 2 4 6 8 10 12

14 5% Latex, 3h

0,5% Latex, 3h 5% Latex, 24h 0,5% Latex, 24h 5% Latex, 48h 0,5% Latex, 48h

ODTD-Peakfläche

RoxA-Konzentration [µg/ml]

Latexmenge notwendig. Somit war der relative ODTD-Ertrag pro Enzymkonzentration bei der Substratkonzentration von 0,5 % am größten. Besonders deutlich wird ein der Reaktionsgeschwindigkeit entgegen wirkender Einfluss einer sehr hohen Substratdichte bei Betrachtung des nach drei Stunden gebildeten Produktes (Abb. 3.19) bei gleichem RoxA-/Latex-Verhältnis, beispielsweise 40 µ g RoxA/ml auf 0,5 % Latex gegenüber 400 µg RoxA/ml auf 5 % Latex. Die absolute ODTD-Menge sollte bei gleicher Umsetzungsrate in letzterem Fall den etwa 10fachen Wert einnehmen als in ersterem Fall, betrug aber weniger als das Doppelte.

Um eine umfassende Betrachtung der Enzym-Substrat-Korrelation vorzunehmen, wären weitere Versuche notwendig. Eine Versuchsreihe mit 3 % Latex lieferte ein ähnliches Resultat wie die Versuche mit 5 %, zeigte aber demgegenüber bereits eine Tendenz, mit geringen Enzym-Konzentrationen höhere ODTD-Mengen im gleichen Zeitraum zu produzieren, wie es deutlich bei 0,5 % beobachtet wurde. Abb. 3.20 veranschaulicht, dass bei hoher Latexkonzentration (3 %) sehr geringe Enzymkonzentrationen (<10 µ g/ml) kaum eine ODTD-Produktion liefern bzw. diese mit steigender Enzymmenge scheinbar überproportional zunimmt. Offenbar spielt das Verhältnis von Latex- zur RoxA-Konzentration eine Rolle, d. h.

mit 200 µg RoxA/ml ist dieses im Hinblick auf die Produktbildung bei 3 % Latex günstiger als mit 20 µg/ml. Möglicherweise wirkt sich das geringe Verhältnis von RoxA zu Latex im hohen Überschuss an Substrat durch Aggregationseffekte der Polymerstränge untereinander in Kombination mit einer Enzymbindung behindernd auf die Umsatzrate aus. Um die Lücke zwischen niedriger und hoher Latexkonzentration zu schließen, böte sich in diesem Zusammenhang eine entsprechende Versuchsreihe bei etwa 1,5 % Latex an, bei der möglicherweise eine noch höhere Umsatzrate zu erwarten wäre.

Abb. 3.20: (links) ODTD-Produktion bei 3 % Latex und unterschiedlichen RoxA-Konzentrationen in Bezug zur Inkubationszeit; (rechts) vergrößerter Ausschnitt aus (links). Der größte Teil des bis zu einer Testdauer von 72 h produzierten ODTD lag bereits nach 24 h vor. Betrachtet man die Situation zu diesem Zeitpunkt, fällt eine überproportionale Zunahme mit höheren Enzymkonzentrationen auf.

0 10 20 30 40 50 60 70

0 5 10 15 20

rel. ODTD-Peakfläche

Inkubationszeit [h]

0 10 20 30 40 50 60 70

0,0 0,2 0,4

0,6 1 µg/ml

2 µg/ml 4 µg/ml 10 µg/ml 20 µg/ml 200 µg/ml

Inkubationszeit [h]

Es wurde beobachtet, dass die ODTD-Produktion bei 30°C verglichen mit derjenigen am Reaktionsoptimum bei 40°C zwar langsamer, doch über einen längeren Zeitraum betrachtet (5 d) bis zu doppelt so hoch lag, etwa bei 10 % der eingesetzten Latexmasse gegenüber 5 %. Da anzunehmen ist, dass das Enzym bei 30°C zwar eine geringere Umsatzrate aufweist als beim Temperaturoptimum von 40°C, aber stabiler ist, erscheint dieses Ergebnis nachvollziehbar.

Bei kurzen Inkubationszeiten würden demnach 40°C-Ansätze höhere ODTD-Erträge liefern, längere Inkubation bei 30°C könnte aber insgesamt zu höheren Ausbeuten führen.

Die Darstellung der Enzym-Substrat-Beziehungen über eine Michaelis-Menten-Kinetik und somit die Angabe eines Km-Wertes ist im Falle von RoxA schwierig, da die Latexspaltung durch RoxA vermutlich nicht dem klassischen Schema der Formierung und Auflösung eines Enzym-Substrat-Komplexes entspricht, das der Kinetik zugrunde liegt.

Aufgrund der hohen Affinität zum Substrat bzw. der Substratmoleküle untereinander ergeben sich weitere Schwierigkeiten, zudem solche aus Art des Aktivitätstests im Hinblick auf die Feststellung von Geschwindigkeiten einer Reaktion (s. Kap. 4.2.3).

Am ehesten eignet sich der Vergleich mit der Testreihe nach drei Stunden, da die Michaelis-Menten-Kinetik Anfangsgeschwindigkeiten betrachtet, und sich der ODTD-Zuwachs mit zunehmender Inkubationszeit verlangsamte. Im Falle einer solchen Enzym-Substrat-Beziehung wäre die Reaktionsgeschwindigkeit (Produktmenge/Zeit) bei hohen Substratkonzentrationen maximal und unabhängig von der Substratkonzentration. Bei einer konstanten Enzymkonzentration von beispielsweise 100 µ g/ml müsste zum gleichen Zeitpunkt mit einer hohen Substratkonzentration (5 %) also mindestens genauso viel Produkt vorliegen als mit einer niedrigeren (0,5 %). Dass bei allen vergleichbaren Enzym-konzentrationen nach drei Stunden aber mit 5 % Latex deutlich weniger Produkt gebildet wurde als mit 0,5 % (s. Abb. 3.19), lässt auf komplexere Enzym-Substrat-Wechselwirkungen schließen. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit wird hier nicht asymptotisch erreicht, sondern ist vermutlich im Bereich eines gewissen Enzym-/Substrat-Verhältnisses maximal.

Liegt Latex in zu hoher absoluter Konzentration vor, ergeben sich möglicherweise durch Aggregationseffekte wieder verminderte Umsatzraten. Die in Kap. 3.6 dargestellten Versuchsergebnisse verdeutlichen, dass nicht nur das Verhältnis der RoxA- zur Latexkonzentration, sondern auch die absolute Konzentration von Substrat- und Enzym Auswirkungen auf die ODTD-Produktion haben.

Die Kenntnis von Substanzen, die in der Lage sind, die Kautschukspaltung durch RoxA zu hemmen, kann prinzipiell wertvolle Informationen zum Mechanismus der Spaltungsreaktion liefern. Eine Auswahl an inhibierenden Substanzen wurde bereits von Braaz et al., (2004) gefunden. Diese Untersuchungen wurden im Zuge des Vergleichs zu anderen Hämproteinen wie Peroxidasen vertieft.