Präparation von ABF1 und Analyse der ABF1-Multimerisierung

Für die vorliegenden Untersuchungen – Analyse der ABF1-DNA-Bindeeigenschaften bzw.

Proteinkomplexe und Quervernetzungsexperimente mit DNA – wurde das ABF1-Protein in E. coli überexprimiert und nach dem modifizierten Reinigungsverfahren nach N. Dank (1997) isoliert. Wegen der Proteinalterung beim Lagern wurde die Reinigung des ABF1’s von Zeit zur Zeit wiederholt, um den Anteil an denaturiertem ABF1-Protein mög-lichst gering zu halten.

4.1.1. Säulenchromatographische Reinigung des rekombinanten ABF1-Proteins

Die Überexpression des rekombinanten ABF1’s erfolgte in E. coli Zellen über den Vektor pQE12-ABF1 (N. Dank, 1997), der den Einbau von sechs Histidinresten am C-Terminus des Proteins ermöglicht. Aus den induzierten Zellen wurde das ABF1-Protein mittels Ni²⁺ -Affinitätschromatographie gereinigt. Das Elutionsprofil des ABF1’s mit Imidazol ist in Abb.

4-1 wiedergegeben. In der Hauptfraktion, die bei 125 mM Imidazol eluiert, waren Protein-abbauprodukte neben intaktem ABF1 enthalten.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Um eine weitere Reinigungsmethode zu optimieren wurde ein kleiner Teil der vereinigten Fraktionen 27-34 des über Ni²⁺-NTA-Agarose gereinigten Proteins (Abb. 4-1) mit Auftrags-puffer (20 mM Tris/HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl) verdünnt und auf eine Spinsäule mit SP-Sepharose aufgetragen. Die Proteinelution von dem Ionenaustauscher erfolgte mit

stei-Abb. 4-1 Elutionsprofil des rekombinanten ABF1’s während der FPLC-Reinigung an Ni²⁺ -NTA-Agarose. Absorption bei 280 nm ist dargestellt; der Verlauf des Imida-zolgradienten ist in das Diagramm eingezeichnet.

48 ERGEBNISSE

gender Menge an NaCl. Die meisten Proteinfragmente binden nicht an der Säule oder wur-den mit 200 mM NaCl ausgewaschen. Danach eluiert das ABF1-Protein bei einer Salzkon-zentration von 300-500 mM (Abb. 4-2).

Aufgrund dieser Ergebnisse erfolgte die weitere Reinigung und Konzentrierung der verei-nigten ABF1-Fraktionen auf einer präparativen SP-Sepharose-Säule. Nach der Dialyse ge-gen Auftragspuffer wurden die Proteine auf die Säule aufgegeben. Nach dem Anlege-gen ei-nes Stufengradienten konnte der größte Teil an bindeaktivem ABF1 mit 450 mM NaCl elu-iert werden (Abb. 4-3).

0 10 20 30 40 50 60

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

ABF1

NaCl, [M]

Absorption bei 280 nm

Fraktionen

Die Kombination von Ni²⁺-Affinitäts- und Ionenaustauschchromatographie (FPLC) erwies sich als ausreichend, um ein >90 % reines ABF1-Protein zu gewinnen. Das SDS-Gel nach Laemmli in Abb. 4-4 zeigt eine Anreicherung des ABF1’s sowie eine Abtrennung der Abbauprodukte.

Abb. 4-2 SDS-PAGE der ABF1-Fraktionen nach der Reinigung mittels einer SP-Sepharose-Spinsäule. Zur Elution wurden schrittweise je 100 µl Auftragspuffer mit steigender Salzkonzentration zuge-geben und je 10 µl des Eluats auf das PAAG aufge-tragen. A: Auftrag; D: Durchbruch; St: Molekularge-wichtsstandard; AP: Proteinabbauprodukte.

Abb. 4-3 Elutionsprofil des vorgereinigten rekombinanten ABF1’s von SP-Sepharose. Absorp-tion bei 280 nm und der Verlauf des NaCl-Gradienten ist dargestellt.

PRÄPARATION VON ABF1 UND ANALYSE DER ABF1-MULTIMERISIERUNG 49

4.1.2. Analyse der Dimerbildung des ABF1-Proteins

Für die geplanten Experimente war es wichtig, die Neigung des ABF1’s zur Multimerisie-rung zu überprüfen. In einem nativen PAAG (Abb. 4-5) wurden die ABF1-ABF1-Komplexe schon bei einer Konzentration von 0,5 µM (10 pmol; Bahn 2) gebildet, bei einer Konzentra-tion von 4 µM (80 pmol; Bahn 5) war das ABF1 zum größten Teil als ein Oligomer vorhan-den. In Anwesenheit von ABF1-spezifischer DNA sind drei Komplexe (K1-K3) sichtbar (Bahn 6). Diese wurden den DNA-Komplexen mit ABF1-Monomeren, Dimeren und Trime-ren zugeordnet.

Die Protein-Behandlung mit Dimethylsuberimidat (DMS) erlaubt eine chemische Querver-netzung der Proteinmultimere (Abb. 4-6). Das ABF1-Protein erwies sich als instabil in Ge-genwart von DMS (Bahn 2), was zu einer Entstehung von Abbauprodukten führte. Die Zu-gabe von ABF1-spezifischem, 27 bp langen ARS1-Element führt nicht nur zur Stabilisierung des Proteins, sondern auch zu einer Bildung von zwei ca. 175 kDa und über 220 kDa gro-ßen Komplexen (K1 und K2). Es ist nicht zu erwarten, dass die Entstehung des

DNA-Abb. 4-4 SDS-Gel des rekombinanten ABF1-Proteins nach der Anreicherung mittels FPLC. Bahn 1 und 6: Molekulargewichtsstandard (HMW, LMW); Bahn 2:

Zellaufschluss nicht induzierter und induzierter Zellen (Bahn 3); Bahn 4: Eluat von Ni²⁺-NTA-Agarose; Bahn 5: Eluat von SP-Sepharose.

Abb. 4-5 Auftrennung der Proteinkom-plexe in 6 % nativem PAAG. K1-K3 entspre-chen den ABF1–DNA-Komplexen in Bahn 6, Proteinmonomere und Dimere sind mit Pfeilen markiert. Bahn 1-4: Proteinfärbung mit Silber;

Bahn 5-7: Coomassie-Färbung. Bahn 1-5:

Proteinverdünnungsreihe in dem Bindungspuffer H01 mit 100 mM NaCl; Bahn 6: vor dem Auftrag wurde das ABF1-Protein mit Überschuss an 27 bp Oligonukleotid xl15p/abf-Ts 10 min bei +4 °C in 20 µl Puffer H01 inkubiert; Bahn 7:

denaturiertes ABF1 (2 min bei 95°C).

50 ERGEBNISSE

Protein-Komplexes (17 kDa + 82 kDa) zu einer deutlichen Massenerhöhung führt. Die Ban-den sind eher als quervernetzte ABF1-Multimere zu deuten.

Nicht alle Bisimidate führen zu einer gleich starken chemi-schen Quervernetzung der Proteine. Durch eine Optimie-rung der Quervernetzungsbedingungen und die Verwen-dung von anderen chemischen Agenten wäre es wahr-scheinlich möglich einen stabileren ABF1-Komplex zu er-halten. Aus den durchgeführten Experimenten konnte die Neigung des ABF1’s, Multimere zu bilden, nachgewiesen werden.

4.1.3. Überexpression und Reinigung der ABF1-Domäne

In mehreren Transkriptionsfaktoren existieren separate DNA-Bindedomäne, die sich weit-gehend unabhängig von anderen Teilen des Proteins falten können. Die Größe des ABF1’s erschwert die ABF1-DNA-Komplexanalyse. Durch eine limitierende Spaltung mit Trypsin ließen sich einzelne stabile ABF1-Domänen identifizieren, die ein spezifisches DNA-Bindungsvermögen aufweisen (Abb. 4-37, Abb. 4-38). Von Interesse war es zu untersu-chen, ob solche isolierten aktiven DNA-Bindedomäne existieren. Um eine mit DNA quer-vernetzte Aminosäure zu identifizieren, wäre es denkbar, nur eine überexprimierte ABF1-Domäne herzustellen und für weitere Untersuchungen zu verwenden. Die hergestellten Proteindomänen sind in der Abb. 4-7 gezeigt.

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Abb. 4-7 Grafische Darstellung der überexprimierten ABF1-Domäne. Die Zahlen entsprechen der AS-Position; pI und MW (in kDa) des jeweiligen Peptides und des ABF1-Proteins wurde berechnet. Zinkfinger und Helix-Turn-Helix (H-T-H)-DNA-Bindemotive sind markiert. E3-E8 entsprechen der Bezeichnung der be-nutzen Primer.

Drei ABF1-Fragmente (176 AS, 215 AS, 237 AS), die ein Zink-Finger-DNA-Bindemotiv ent-halten, wurden mittels PCR hergestellt und in den pQE12-Vektor kloniert. Nach der

Se-Abb. 4-6 Auftrennung der ABF1-Komplexe im 8 % SDS-Gel nach der Behandlung mit DMS. K1- und K2-Komplexe entste-hen nach der Zugabe von dsDNA zu ABF1 (Bahn 1). Das Protein wurde mit Coomassie visualisiert.

DNA-BINDUNGSEIGENSCHAFTEN VON ABF1 51

quenzierung des klonierten Abschnittes wurde die ABF1-Domäne in E. coli überexprimiert.

Die Reinigung des Proteins erfolgte unter nativen und denaturierenden (mit 8 M Harnstoff) Bedingungen mittels Ni²⁺-NTA-Spinsäule (Qiagen, Hilden) (Abb. 4-8).

Das am C-Terminus eingefügte HisTaq wurde anscheinend nicht auf der Proteinoberfläche exponiert, weshalb das E3E6-Protein nur unter denaturierenden Bedingungen gereinigt werden konnte. Das rekombinante E3E5- bzw. E3E7-Protein besitzt ebenfalls keine nach-weisbaren DNA-Bindungseigenschaften. Die Proteinfaltung verläuft wahrscheinlich durch eine Verkürzung des Proteins anders, als bei nativem ABF1. Eine Herstellung des ca.

60 kDa großen E3E8-Proteins, das beide DNA-Bindedomäne beinhaltet, verlief erfolgreich, wobei eine niedrigere Bindungsaktivität des verkürzten Proteins im Vergleich mit dem wt ABF1 beobachtet wurde. Daraus konnte nichts über die Eigenschaften der einzelnen DNA-Bindedomäne abgeleitet werden. Aufgrund der niedrigeren Bindungsaktivität erschien es nicht sinnvoll, das Protein E3E8 in die Quervernetzungsexperimente einzusetzen.