Photochemische Herstellung und Reinigung des Sporenphotoproduktes in DNA

definierten Sporenphotoproduktes durch UV-Bestrahlung in DNA veröffentlicht, so dass zunächst diverse Belichtungsbedingungen getestet wurden, um die größtmöglichste Ausbeute und Reinheit eines Sporenphotoschadens in DNA zu ermitteln. Die Anwesenheit von DPA hat eine nachgewiesene große Auswirkung auf die Menge und Art der entstehenden Photodimerschäden, wobei die Eigenabsorption von DPA aus photophysikalischer Sicht die wesentliche Ursache dafür ist.

Abbildung 4-15: UV-Vis Spektrum von Pyridin-2,6-dicarbonsäure.

Aus diesem Grund wurde ein Absorptionsspektrum von DPA in wässriger Lösung bei einem physiologischen pH-Wert von 7,0 aufgenommen. Dazu wurde das Spektrum von 350-200 nm einer 100 µM DPA-CaCl Lösung in einem UV-Vis Spektrometer gemessen (Abbildung 4-15).

Dabei zeigte sich, dass der DPA-Ca Komplexes mehrere Absorptionsmaxima aufweist. Das langwelligste liegt bei 280 nm, zwei weitere bei 270 nm bzw. 260 nm und das kurzwelligste bei 220 nm. Insgesamt ist die Absorption im UV-C und UV-B Bereich sehr hoch. Deshalb wurde für die Belichtungsexperimente eine Wellenlänge von 254 nm für die Generierung des Sporenphotoschadens in DNA verwendet.

Als nächstes wurde für die Bestimmung des optimalen DPA-CaCl/DNA Verhältnisses eine Messreihe mit unterschiedlichen DPA-CaCl2 Konzentrationen durchgeführt. Die DNA Konzentration wurde dazu konstant auf 125 µM in einer Lösung (pH 7,0, 100 mM NaCl) eingestellt und die jeweiligen Menge an DPA-Ca wurde hinzugegeben Danach wurden die Lösungen in einer 6-well-Zellkulturschale bis zur Trockenheit lyophilisiert und in eine Glovebox eingeschleust. Nach einer konstanten Belichtungszeit von 12 h unter anaeroben Bedingungen wurde der belichtete weiße, poröse Film in den einzelnen Kavitäten mit ddH2O wieder resuspendiert und auf einer analytischen rp-HPLC quantifiziert.

Abbildung 4-16: Sporenphotoproduktbildung (SP) unter Standardbedingungen (12 Belichtungszeit, anaeob, lyophilisiert, 254 nm) und ansteigendender DPA-Ca Konzentration.

Für diese Belichtungsexperimente wurde ein DNA Strang mit der Sequenz 5´-GGTTGG-3`

verwendet. Die ausgewählte DNA Sequenz lässt sich sehr gut von den entstandenen Photoprodukten auf der rp-HPLC trennen. Zudem bilden sich kaum Nebenprodukte bei einer längeren UV Belichtung. Die Peaks auf dem HPL-Chromatogramm wurden integriert, addiert

zusammengefasst und zeigen einen linearen Anstieg an Sporenphotoproduktbildung (SP) bis zu einer DPA-Ca Konzentration von 5 mM. Bei DPA-Ca Konzentrationen oberhalb von 5 mM kommt es zu keiner vermehrten SP Bildung. Offensichtlich ist die DNA bei diesem Verhältnis gesättigt. Bei sehr hohen DPA-Ca Konzentrationen und damit einer Verschiebungen des Verhältnisses in Richtung DPA-Ca, kommt es zu keiner verbesserten SP Ausbeute. Der stattfindende photochemische Mechanismus weist also ein Maximum auf, welches durch ein Verhältnis zwischen DPA-Ca/ DNA von 40 erreicht wird. Eine Änderung dieses Verhältnisses resultiert nicht in einer Ausbeute Verbesserung, kann aber zu einer Verschlechterung führen.

Für alle weiteren Experimente wurde deshalb eine DPA-Ca Konzentration von 5 mM gewählt, um ein DPA-Ca/ DNA Verhältnis von 40 einzustellen.

In der nächsten Versuchsreihe wurde die Belichtungsdauer bzw. die Lichtenergie (J m^-2 min^-1) variiert, um weitere kinetische Informationen über die SP Bildung zu erhalten. Bei diesem Experiment wurden alle Parameter der vorhergehenden Messreihe übernommen. Es wurde lediglich die Belichtungsdauer variiert. Dazu wurden jeweils nach 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 16 Stunden in drei verschieden Kavitäten 100 µL ddH2O hinzugegeben. Der lyophilisierte Film wurde mit diesen 100 µL resuspendiert, aus der Glovebox ausgeschleust und durch rp-HPLC analysiert. Die Belichtung wurde dazu für ca. 3 min unterbrochen. Die Auswertung erfolgte analog der vorherigen. Die zugehörigen Ergebnisse sind in Abbildung 4-17 dargestellt.

Hierbei zeigt sich eine fast lineare Zunahme der SP Bildung von der ersten bis zur fünften Stunde.

Abbildung 4-17: Sporenphotoproduktbildung mit ansteigender UV-Licht Exposition.

Die SP Bildung innerhalb der ersten Stunde ist jedoch am höchsten. Während der ersten sechzig Minuten bildet sich fast die Hälfte der endgültigen maximalen Ausbeute an SP.

Dieses Maximum von 6,6 % wird nach fünf Stunden erreicht. Nach diesen fünf Stunden kommt es wieder zu einer leichten Abnahme an SP. Dieses ist dadurch zu erklären, dass nach dieser Zeit das HPL-Chomatogramm weitere Peaks aufweist. Eine nähere Analyse wurde nicht durchgeführt. Es könnte sich hierbei um CPD, (6-4) Photoprodukte oder hydrolysierte Produkte der DNA bzw. Belichtungsschale handeln. Die Nebenproduktbildung steigt nach einer fünfstündigen Belichtungszeit durch den hohen Energieeintrag also stark an. Einen Grund für das Erreichen eines Maximums an SP Bildung könnte auch an der Inhomogenität des DNA/DPA-Ca Films zu finden sein. Dieses Gemisch bildet während dem Lyophilisierungsvorgang keinen homogenen Film. An einigen Stellen ist ein dünner weißer Film zu sehen, der sich auf der Oberfläche der Zellkulturschalen bildet. An anderen Stellen entstehen flockenartige und poröse Strukturen, welche durch äußere Krafteinwirkung zu einem sehr feinen weißen Pulver werden. Diese Beobachtung lässt den Schluss zu, dass nur in bestimmten Bereichen des Films der richtig DPA-assozierten-Komplex vorliegt. Eine reversible Reaktion ist auszuschließen, da sie experimentell nicht beobachtet werden konnte.

Dazu wurde gereinigtes SP wieder resuspendiert, lyophilisiert und belichtet. Im HPL-Chromatogramm zeigten sich daraufhin keine neuen Peaks und auch kein Peak im Retentionsbereich von ungeschädigter DNA.

Abbildung 4-18: Präparative Reinigung des SP in DNA nach Belichtung mit UV-Licht. (schwarz:

Chromatogramm der gesamten Belichtungsprodukte; rot: Chromatogramm des gereinigten SP in DNA;

SP=Sporenphotoprodukt, X=Nebenprodukte, Edukt=ungeschädigte DNA)

Durch die vorhergehenden empirischen Experimente konnten die optimalen Belichtungsbedingungen für eine möglichst saubere und quantitative SP Bildung in DNA ermittelt werden. Für die quantitative Belichtung eines 6mer DNA Einzelstrangs (5`-GGTTGG-3`) und eines 9mer DNA Einzelstrangs (5´-GGAATTAAG-3`) wurde die DNA deshalb in Gegenwart von 5 mM DPA-Ca lyophilisiert und im Anschluss bei RT für 5 h belichtet. Die Reinigung erfolgte mittels rp-HPLC. In Abbildung 4-18 sind die Chromatogramme vor und nach der Reinigung zu sehen. Das schwarz colorierte Chromatogramm zeigt das Peakmuster direkt nach der Belichtung. Es enstehen drei zusätzliche Peaks, von denen der erste (RT: 42,5 min) eindeutig als Sporenphotoprodukt identifiziert werden konnte. Die Identifizierung der Belichtungsprodukte erfolgte durch einen enzymatischen Totalverdau der DNA. Nach diesem Verdau sind die jeweilgen Phosphordiesterbindungen gespalten und und liegen als Nukleotide vor. Die verwendeten Enzyme katalysieren nicht die Monomerisierung von Photodimeren, so dass die Photodimere sehr gut durch Massenspektrometrie identifiziert werden können. Dazu wurden die enzymatisch verdauten DNA Proben zuerst durch rp-HPLC getrennt und dann auf einem Massenspektrometer mit ESI-Quelle gemessen.

Bei dem zweiten Peak (RT: 43,5 min) handelt es sich um ein Photoprodukt, welches bislang nicht identifiziert werden konnte. Bei dem dritten Peak handelt es sich um Sekundärstrukturen des DNA Strangs. Dieser Peak ist ebenfalls in unbelichteten Fraktionen zu finden und verschwindet fast vollständig, wenn die rp-HPLC Säule erhitzt wird. Die Fraktionen des DNA Strangs mit SP wurden gesammelt und entsalzt. Das rot colorierte rp-HPL-Chromatogramm in Abbildung 4-18 zeigt einen analytischen Lauf des gereinigten DNA Strangs mit SP. In dieser Form wurde der DNA Strang nach einer photometrischen Quantifizierung in die jeweiligen Experimente eingesetzt.

Das Massenspektrum von dieser Messung ist in Abbildung 4-19 A dargestellt. Darin stimmt der dominante Massenpeak von 545,1285 sehr gut mit dem berechneten Massenpeak von 545,1290 für das SP überein. Die gleiche Masse weisen jedoch auch CPD und (6-4) Photoprodukt auf. Aus diesem Grund wurde eine weitere Fragmentierung (MS/MS) der Masse von 545,1285 durchgeführt. Durch den weiteren Energieeintrag kommt es unter anderem zu Spaltung der N-glykosidischen Bindung und damit zu einer Nukleotidspaltung in Basen- und Zuckermoleküle.

Als Ergebnis erhält man ein typisches Fragmentierungsmuster, welches für jeden Photodimerschaden einzigartig ist. Das erhaltene Fragmentierungsmuster ist in Abbildung 4-19 B dargestellt und entspricht dem von Douki et al. veröffentlichten Fragmentierungsmuster

für das Sporenphotoprodukt.^[244] Hierbei ist sehr deutlich die Masse des Basendimers mit 251,1 zu sehen. Zusätzlich sind die Massen des Deoxyribosephosphatrestes (dRP) mit 195,1 und die Gesamtmasse ohne 2-Deoxyribose (M-dR) mit 447,1 zu erkennen. Das erhaltene Fragmentierungsmuster unterscheidet sich von denen des CPD und (6-4) Photoproduktes, so dass das Vorhandensein des SP in DNA mittels Massenspektrometrie bewiesen wurde.

Abbildung 4-19: Massenspektren vom Sporenphotoprodukt. A) Massenspektrum nach HPLC-MS, B) Massenspektrum des fragmentierten Sporenphotoprodukts.