DNA im Sporenkern

Da die DNA im Inneren der Spore, also im Sporenkern vorliegt, ist das Milieu des Sporenkerns die unmittelbare Umgebung der DNA. Hier sind der Gehalt an zwei niedermolekularen Substanzen und einem Protein von entscheidender Bedeutung. Die erste niedermolekulare Substanz ist Wasser. In protoplastierten vegetativen Bacillus und Clostridium Zellen liegt der H2O Gehalt zwischen 75 und 80 Gewichtsprozent, wohingegen im Sporenkern lediglich 27 bis 55 Gewichtsprozent Wasser vorhanden sind.^[70] Der Wasseranteil im Sporenkern ist also extrem gering, so dass die Bewegung von Makromolekülen, auch die der DNA, stark eingeschränkt wird.^[71] Der geringe Wassergehalt ist sicherlich der Hauptgrund für die Beendigung jeglicher enzymatischen Aktivität, und auch der wichtigste Faktor für die Resistenz der Sporen gegen feuchte Hitze.^[70] Der Mechanismus um den Wassergehalt während der Sporulation in der Spore und im Sporenkern so stark zu reduzieren ist jedoch weiterhin unbekannt. Während der Sporengermination findet die Rehydratisierung des Sporenkerns sehr schnell, innerhalb der ersten 5 min statt. Die Sporenhülle bricht auf und makromolekulare Bewegung und Enzymaktivität sind wieder vorhanden.^{[[71, 72]}

Die zweite niedermolekulare Verbindung ist die Pyridin-2,6-dicarbonsäure (Dipicolinsäure, DPA) (Schema 1-7). Dieses Molekül ist zu einem Anteil von 5-15% des Trockengewichts in den Sporen der Gattung Bacillus bzw. Clostridium vorhanden. In den Sporen ist diese Substanz ausschließlich im Sporenkern lokalisiert, und dort mit zweiwertig positiven Kationen wie Ca²⁺ im Verhältnis 1:1 chelatiert.[70, 73-75]

Die Menge an DPA oder DPA-Ca²⁺ Komplexen im Sporenkern liegt weit über der Löslichkeitsgrenze. Es wird angenommen, dass DPA im Sporenkern eine glasähnliche Struktur ausbildet, was bisher aber noch nicht eindeutig belegt werden konnte.^{[76, 77]} DPA wird zum Zeitpunkt der Sporulation in der Mutterzelle synthetisiert, danach im Sporenkern der Vorspore akkumuliert und innerhalb der ersten Minuten, während der Sporengermination, wieder ausgeschieden. Der Mechanimus des DPA Exozytose ist bislang unbekannt.

Schema 1-7: Komplex aus Pyridine-2,6-dicarboxylsäure mit Ca²⁺ im Verhältnis 1:1.

Die Anhäufung von DPA im Sporenkern und die Komplexierung mit Wasser führen zu einer zusätzlichen Verringerung an freien Wassermolekülen im Sporenkern. Gentechnisch veränderte Zellen, deren DPA Synthese nicht mehr funktioniert, weisen einen erhöhten Wassergehalt im Sporenkern auf.^[78]

Die letzte der drei wichtigen Komponenten im Sporenkern ist das Vorkommen der small acid soluble proteins (SASP).^{[79, 80]} Diese Proteine haben eine extrem hohe DNA Affinität und komplexieren auch mit dieser. Die Bindung ist dabei unabhängig von der DNA Sequenz. Die SASP´s werden nur in der Vorspore im letzten Abschnitt der Sporulation, kurz vor der Aufnahme der DPA und der Dehydratisierung, synthetisiert. Diese nur 60 -75 Aminosäure langen Proteine sind in hohen Konzentrationen in den Sporen vorhanden, und machen 3-6 % des Totalproteingehalts der Sporen aus. Die α/β- Typ SASP´s sind das Produkt einer Multigenfamilie von 4-7 Genen, die über das gesamte Genom von Bacillus Arten verteilt sind.

Die Aminosäuresequenz ist hochgradig konserviert, und das auch zwischen der Bacillus und Clostridium Gattung. Es gibt einige unterschiedliche SASP Typen, wobei der α/β –Typ 80 % des gesamten SASP Pools ausmacht. Die SASP´s werden in der frühen Phase der Sporengermination von speziellen Proteasen proteolytisch abgebaut und dienen dann als Aminosäurequelle für die Proteinbiosynthese der vegegativen Zelle.^[81] Bis auf Cystein und Tryptophan sind alle Aminosäuren in den SASP´s vorhanden. Die DNA ist nun zugänglich für die anschließende Reparatur und Transkription. Werden die SASP ´s nicht quantitativ von der DNA entfernt, wird eine starke Verschlechterung der DNA Transkription, und damit verbunden der Sporengermination, festgestellt. ^{[81, 82]} Die Überexpression dieser Proteine in E.

coli ist deshalb nur mit ausgewählten engineerten SASP Varianten möglich, da auch hier durch DNA Bindung die Transkription blockiert wird.

Die Komplexierung der DNA mit diesen Proteinen spielt eine entscheidende Rolle beim Schutz der DNA vor Hitze, Trockenheit, Oxidationsmitteln und UV-Strahlung. Es konnte gezeigt werden, dass SASP Deletionsmutanten (α^-/β^-) gegenüber den oben aufgeführten Umwelteinflüssen weitaus weniger resistent sind, als der Wildtyp.^[83-85] Aus diesem Grund wird im Folgenden die DNA/SASP Komplexstruktur genauer beschrieben. Erst im Jahr 2005

konnten Wolf et al. die ersten guten elektronenmikroskopischen Aufnahmen einer DNA-SASP Struktur erhalten.^[86] Dazu wurde ein DNA Plasmid zusammen mit einer engineerten SASP Variante (SspC) in vitro inkubiert und danach im Elektronenmikroskop visualisiert (Abbildung 1-5). Die SspC Variante wurde gewählt, da diese sich am Besten in E. coli überexprimieren lässt, und somit in großen Mengen zur Verfügung steht.^[87]

Abbildung 1-5: Elektronenmikroskopie-Aufnahme eines DNA-SspC-Komplexes in vitro bestehend aus Plasmid DNA und SspC-Filamenten.^[86]

Die aufgenommenen Bilder zeigten, dass das Protein die DNA vollständig umgibt und eine 5,5 nm breite helikale Struktur bildet. Die über die DNA herausstehenden SspC Einheiten ermöglichen eine Verzahnung der benachbarten DNA-Protein-Filamente zu einer dicht gepackten Anordnung von Nucleoproteinhelices. Die Struktur der DNA verändert sich bei der Bindung durch SspC nur geringfügig. Der Abstand zweier Nucleobasen von 0,317 nm (Abbildung 1-6) unterscheidet sich kaum von normaler B-DNA (0,34 nm). Durch die Simulation einer 3D Strukturanalyse vermuten die Autoren, dass die quaternäre Organisation der DNA-SspC-Filamente entscheidend für den Schutz und die erhöhte Superhelicität der DNA ist. Innerhalb dieser quaternären DNA-Protein Bündel, welche nahezu perfekt verzahnte Filamente aufweisen, ist der Wassergehalt stark reduziert (Abbildung1-7). Es liegen zwischen benachbarten DNA-SspC-Filamenten sowohl antiparallele wie parallele Kontakte vor, da die DNA in einer geschlossenen Ringform vorliegt. Die kryoelektronenmikroskopische Studie zeigte, dass die parallelen Wechselwirkungen schwächer sind, da parallele, benachbarte Filamente eine geringere Komplementarität aufweisen. Die dichteren, antiparallelen Kontakte stabilisieren die dreidimensionale Anordnung der Filamente und kompensieren die

schwächeren parallelen Kontakte. Es kommt also zu der bereits beschriebenen dichten Verzahnung. Zusammen mit dem ohnehin schon geringen Wassergehalt im Sporenkern, könnte dieser Effekt, zu einer weiteren Reduktion des Angriffs von reaktiven Sauerstoff Radikalen an der DNA führen. Es kommt also in der Folge zu weniger oxidativen DNA Schäden.

Abbildung 1-6: Vergleich der Ganghöhe in B-DNA (A) mit der DNA im SspC-Komplex (B).

In der Studie konnte des Weiteren gezeigt werden, dass mit SspC gesättigte DNA sowohl in vitro als auch in vivo eine dicht gepackte toroidale Struktur bildet. Diese ungewöhnliche toroidale Morphologie wurde auch im Bakterium Deinococcus radiodurans gefunden.^{[88, 89]}

Dieses Bakterium besitzt eine erstaunlich hohe Resistenz gegenüber ionisierender Strahlung und Trockenheit. Es ist in der Lage eine Strahlendosis von 15.000 Gy zu überleben, für normale Organismen ist schon eine Dosis von 10 Gy lethal. Diese hohe Resistenz wird auf die toroidale Struktur der DNA in diesem Bakterium zurückgeführt. Allerdings zeigte sich in anderen Studien, dass die SASP´s für die γ- Strahlenresistenz der Sporen keine Rolle spielen.^{[90, 91]} Es ist also anzunehmen, dass diese Gemeinsamkeit eher mit der reduzierten Wasserkonzentration in Gegenwart der DNA zusammenhängt, denn auch bei Deinococcus radiodurans ist die DNA so dicht gepackt, dass sogar die Diffusion der DNA Enden unterdrückt wird.

In Hefesporen gibt es weder hohe Konzentrationen an Dipicolinsäure, noch ist die DNA von SASP (small acid soluble proteins) ummantelt. Die Photochemie der DNA ist also eher entsprechend einer vegetativen Zelle.

Abbildung 1-7: Dreidimensionale Anordnung von vier benachbarten Filamenten. A) Aufsicht auf die

Filamente. Das dunkelgrau eingefärbte Filament bildet antiparallele Kontakte mit den anderen drei Filamenten aus. B) Schematische Aufsicht, der Anordnung von parallelen (+) und antiparallelen Filamenten (-) in einer hexagonalen Überstruktur.