Gateway Technologie

Die Gateway-Technologie beruht auf dem Prinzip der natürlichen Amplifikation des λ-Phagen in E. coli. Im lytischen Zyklus wird die λ-Phagen-DNA vermehrt und in neue λ-Phagen verpackt, während im lysogenen Zyklus die DNA als „stille DNA“ in das Chromosom integriert wird. Dieses geschieht mit Hilfe der Phagen Enzyme Integrase (Int), der Excisionase (Xis) und dem Protein IHF (= integration host factor) aus E. coli.

Im lysogenen Zyklus integriert der λ-Phage über Attachment-Sites, attP auf der DNA des Phagen und attB auf dem Genom von E. coli, λ-Phagen DNA Fragmente in das E. coli Genom. Nach der Integration (= lysogener Zyklus) enthält das E. coli Genom Phagen DNA, die durch die Sites attL und attR flankiert wird. Diese sind aus den Attachment-Sites attB und attP entstanden ^[223]. Der Austauch wird durch die Enzyme Integrase und dem Protein IHF katalysiert.

Um den lytischen Zyklus zu starten, wird die λ-Phagen DNA mit Hilfe des Enzyms Excisionase aus dem E. coli Genom freigesetzt. Hierbei wirken wiederum Integrase und IHF mit, um die Bildung von attL- und attR-sites umzukehren und um somit wieder attP flankierte λ-Phagen DNA herzustellen.

Amplifiziert man nun ein DNA-Fragment durch PCR unter Verwendung von Primern, welche die Attachment-Sites attB enthalten, lässt sich dieses PCR Produkt nun durch die Gateway-Technologie über die BP-Reaktion (stammt vom lysogenen Zyklus) in einen Entryvektor bzw.

durch die LR-Reaktion (stammt vom lytischen Zyklus) in einen Expressionsvektor klonieren.

Der Vorteil einer 2 stufigen Reaktion ist, dass sobald ein Entry-Klon nach der BP-Reaktion existiert, man diesen in alle erhältlichen Expressionsvektoren durch nur einen Schritt klonieren kann. Es sind also keine weiteren Sequenzierungen, Ligation oder Restriktionen notwendig. So ist z.B. ein Wechsel des Expressionssystem von Prokaryonten zu Eukaryonten schnell und einfach möglich.

3.3.11.1 BP-Reaktion

Das durch PCR amplifizierte DNA-Produkt wird mittels der BP-Reaktion in einen Donor-Vektor (pDONR201) integriert. Auf dem Plasmid ist das ccdB Gen, welches ein DNA-Gyrase-Inhibitor kodiert, von den Attachment-Sites attP umrahmt. Das amplifizierte PCR Produkt ist durch die Attachment-Sites attB flankiert. Diese Attachment sites werden von dem λ-Phagen Enzym Integrase und dem Integration Host Factor (IHF) genutzt, um das zwischen den attB-sites liegende PCR- Fragment mit dem zwischen den attP-sites liegende ccdB Gen auszutauschen. Bei dem Austausch der beiden Fragmente wird jeweils ein Teil dieser Erkennungssequenzen, welcher direkt an den Fragmenten gebunden sind, mitgenommen. Als Resultat entsteht ein Entry-Klon mit dem gewünschten DNA-Fragment, flankiert durch die Attachment-Sites attL und ein by-Produkt (= Nebenprodukt), welches das ccdB-Gen enthält, flankiert durch die Attachment-Sites attR.

Abbildung 3-1: BP-Reaktion zur Herstellung eines Entry-Klones (Invitrogen, Online-Katalog 2006).

Die Reaktion wurde in einem 1,5 mL Reaktionsgefäß durchgeführt:

x µL PCR-Produkt (15- 150ng ) mit attB-Sites 1 µL pDONR 201 (150 ng/µL)

ad 8 µL TE-Puffer

Die bei –80° C gelagerte BP-ClonaseII wurde auf Eis 2 min aufgetaut, 2 x gevortext und 2 µL in das 1,5 mL Reaktionsgefäß hinzugegeben. Die Reaktion wurde ü.N. bei 25°C im Thermomixer inkubiert. Am darauf folgenden Morgen wurde die Reaktion durch die Zugabe von 1 µL Proteinase K mit 10 min bei 37°C abgestoppt.

Im Anschluss wurden jeweils 4 µL des Reaktionsansatzes in 50 µL E. coli DH5α elektrotransformiert bzw. 2 µL in TOP10 durch Hitzetransformation. Die Selektion nach einer Transformation beruht auf den Prinzipien, dass erstens nur die Transformaten, die eine Kanamycinresistenz aufweisen und zweitens kein DNA-Gyrase-Inhibitor translatieren, auf kanamycinhaltigem Nährboden wachsen. Die isolierten Plasmide wurden nun in der unter 3.3.11.2 beschriebenen LR-Reaktion eingesetzt.

3.3.11.2 LR-Reaktion

Bei dem zweiten Reaktionsschritt des Gateway-Systems wurde das DNA-Fragment, welches zwischen den Attachment-Sites attL im Entry-Vektor sitzt, in einen Destinations Vektor kloniert. Diese Vektoren enthalten ebenfalls das ccdB Gen für die DNA-Gyrase-Inhibition, welches hier wiederum durch die Attachment-Sites attR flankiert wird. Das Enzym Excisionase setzt zuerst die attR und attP Sites flankiernden DNA Fragmente frei, welche im Anschluss durch die umgekehrte Katalyse von Integrase und dem Integration Host Factor ausgetaucht werden. Es kommt also zu einem Wechsel der Fragmente zwischen dem Entry-Vektor und dem Destination-Entry-Vektor. Das Ergebnis der Reaktion ist ein Expressions-Klon, welcher das ursprüngliche PCR-Produkt mit seinen ursprünglichen Attachment-Sites attB enhält, sowie ein by-Produkt, bestehend aus dem ccdB Gen, eingerahmt von den Attachment-Sites attP. Dieser neu entstanden Vektor wird als pExp bezeichnet (Abb. 3-2).

Abbildung 3-2: LR-Reaktion zur Herstellung eines Expressions-Klones (Invitrogen, Online-Katalog 2006).

Die Reaktion wurde in einem 1,5 mL Reaktionsgefäß durchgeführt:

x µL pENTR x (50-150ng) 1 µL pDEST x (150 ng/µL) ad 8 µL TE-Puffer

Der LR-ClonaseII-Mix aus dem –80°C Gefrierschrank wurden auf Eis 2 min aufgetaut, 2 x gevortext und 2 µL des Enzymmix in das 1,5 mL Reagiergefäß hinzugegeben. Die Reaktion wurde ü.N. bei 25°C im Thermomixer inkubiert. Am darauffolgenden Morgen wurde die Reaktion durch die Zugabe von 1 µL Proteinase K mit 10 min bei 37°C abgestoppt.

Anschließend wurden 4 µL des Reaktionsansatzes in 50 µL E. coli DH5α transformiert. Die Selektion nach einer Transformation beruht auf den Prinzipien, dass erstens nur die Transformaten, die eine Ampicillinresistenz aufweisen, und zweitens kein DNA-Gyrase-Inhibitor translatierten auf ampicillinhaltigem Nährboden wachsen. Die isolierten Plasmide wurden nun in verschieden Expressions Stämme transformiert, um den Stamm mit der höchsten Proteinexpressionrate zu bestimmen.

3.3.12.3 Herstellung von neuen Destinations Plasmiden

Durch Integration der Gatewaykassette an der Stelle der MCS lässt sich jedes Plasmid in einen Destination Vektor umwandeln. Dabei muss darauf geachtet werden, dass das Plasmid nicht ausschließlich eine Kanamycinresistenz kodiert, da ansonsten keine positive Selektion durchgeführt werden kann. Zuerst muss das gewünschte Plasmid linearisiert werden und mit blunt ends versehen werden. Dieses wurde durch die weiter oben beschriebenen Techniken erreicht. Um im Leserahmen des jeweiligen Plasmides zu bleiben, musste die Gatewaykassette dementsprechend durch eine PCR amplifiziert werden. Im Anschluss wurde das PCR Produkt in den Vektor ligiert und in DB3.1 Zellen transformiert. Es wurde also auf das Vorhandensein der Gatewaykassette selektioniert. Die DB3.1 Zellen mussten verwendet werden, da dieser E. coli Substamm einen Inhibitor für den DNA Gyrase Inhibitor enthält, welcher von dem ccdB-Gen kodiert wird. Auf der Gatewaykassette ist ebenfalls das Gen für Chloramphenicol Acetyltransferase kodiert, welches eine sichere Amplifikation des Vektors in DB.3.1 E. coli Zellen ermöglicht. Die gewachsenen Kolonien wurden amplifiziert und eine Plasmidpräparation durchgeführt. In der nächsten Stufe wurden diese Plasmide in TOP10

transformiert. Diese Zellen mussten sterben, da das ccdB-Gen zur negativ Selektion verwendet wurde. Im Anschluss wurden die Plasmide zum Sequenzieren gesendet.