Obwohl die Wachstumsfaktoren eine wichtige Rolle beim Erhalt der Vitalität sowie der Stimula-tion von ProliferaStimula-tion und Differenzierung spielen, sind sie nur ein Ausschnitt des regulatorischen Netzwerkes der Hämatopoese. In Kap. 1.6 wurde bereits auf die Bedeutung des pH-Wertes und der Gelöstsauerstoffkonzentration in vivo und in vitro auf die Granulopoese hingewiesen. Bei der Übersicht über die Literatur ist jedoch nicht zu übersehen, daß eine kontrollierte und isolierte Beurteilung dieser Effekte bisher mangels geeigneter Kultivierungssysteme nicht möglich war.
Mit dem in dieser Arbeit konstruierten und etablierten Mini-Spinner steht erstmals ein Kultivie-rungssystem zur Verfügung, das zusammen mit der cellferm pro Anlage (DASGIP) die geregelte und kontrollierte Kultivierung von primären hämatopoetischen Zellen in einem vierfach-parallelen Ansatz ermöglicht. Der Mini-Spinner wurde in diesen Versuchen als geschütteltes System mit einem minimalen Arbeitsvolumen von 20 mL betrieben. Ausgehend von einem Inokulum-Volumen von 35 mL sind somit im Verlauf der Kultivierung mehrere Probenahmen auch größeren Volumens für durchflußzytometrische Analysen möglich.
Zur Untersuchung des Einflusses des pO2-Wertes auf das Wachstumsverhalten und die Differen-zierung neutrophiler (Vorläufer-) Zellen wurden CD34+ hämatopoetische Zellen im Mini-Spinner
inokuliert und mit dem Fermentationssystem cellferm pro (DASGIP) über einen Zeitraum von 14 Tagen pH- und pO2- kontrolliert kultiviert. In den untersuchten Ansätzen wurde die Gelöstsau-erstoffkonzentration im Medium durch Variation des Sauerstoffanteils in der Zuluft für jedes Gefäß individuell geregelt. Die Gelöstsauerstoffkonzentrationen im Medium wurden im Bereich von DO = 5%, 25%, 50% und 75% variiert (luftgesättigtes Medium enthält unter Normalbedin-gungen etwa 8,2 mg·kg-1 Sauerstoff; dieser Wert wird 100% DO (dissolved oxygen) gesetzt).
Die weiteren Parameter der Kultivierung sind in Tabelle 8-9 zusammengefaßt.
Tabelle 8-9: Kulturparameter zur Untersuchung des Einflusses der Gelöstsauerstoff-konzentration auf Proliferation und Differenzierung humaner neutrophiler Zellen aus CD34+ Zellen
Zellen CD34+ Zellen aus CB, 3 Spender
Medium SCGM Medium
Ausgangszelldichte 1·104 Z·mL-1
Wachstumsfaktoren SCF, IL-3, IL-6, G-CSF
Versuchsansätze Gelöstsauerstoff des Mediums über den O2-Anteil in der Zuluft geregelt auf 5 %DO
25% DO 50% DO 95% DO
(luftgesättigtes Medium bei Standardbedingungen ist 100% DO gesetzt) Kultursystem Mini-Spinner, ohne Rührung, auf Schüttelplatte
Kulturvolumen 30 mL
Kulturdauer 14 Tage
Die Gesamtzell-Expansion variierte deutlich mit der eingestellten Sauerstoffkonzentration (Abbildung 8-14). Für die beiden mittleren eingestellten Gelöstsauerstoffkonzentrationen (25%
DO und 50% DO) konnten die höchsten Zelldichten und damit die höchsten Gesamtzellzahlen erreicht werden. Die niedrigste eingestellte Sauerstoffkonzentration lieferte auch die niedrigsten Zellzahlen. Alle Ansätze erreichen ihre maximale Wachstumsrate nach 168 h Kultivieurng. Die deutlich bessere Zellproduktion der auf 50% bzw. 25% DO geregelten Ansätze zeigt sich erst nach ca. 200 h. Danach bleibt die Staffelung der Zell-Expansionen für die restliche Kulturdauer erhalten. Interessanterweise nimmt die Vitalität der inokulierten Zellen in allen Ansätzen von Tag 0 bis Tag 5 ab, erholt sich jedoch nach Überwinden der lag-Phase und bleibt auf relativ hohem Niveau von ca. 80% bis zum Abbruch der Kultivierung nach 14 Tagen erhalten.
Abbildung 8-14: Einfluß der Gelöstsauerstoffkonzentration auf Gesamtzellzahl und Vitalität bei der Generierung humaner neutrophiler Zellen aus CD34+ Zellen
Der Anteil an neutrophilen Vorläuferzellen an der Gesamtzell-Population wurde am Ende der lag-Phase nach 168 h Kultivierung, inmitten der exponentiellen Wachstumsphase (216 h) und zu Beginn der Plateauphase nach 264 h bestimmt. Tabelle 8-10 zeigt den Anteil der Zellen mit dem neutrophilen Differenzierungsmarker CD15 an der Gesamtzellpopulation. Abgesehen von der niedrigsten Gelöstsauerstoff-Konzentration wächst der Anteil der neutrophil differenzieren-den Zellen in differenzieren-den Ansätzen mit 75% DO, 50% DO bzw. 25% DO auf > 60% an. Die niedrigste Sauerstoff-Konzentration liefert über die gesamte Kulturdauer hinweg geringere Mengen an CD15+ Zellen. Der Anteil an CD15-CD11b+ Zellen, die der monozytären Differenzierungsrich-tung zuzuordnen sind, liegt hingegen bei Kultivierung mit 5% DO durchweg höher als bei den verglichenen Ansätzen. Nach 216 h Kultivierung bei 5% DO erreicht der Anteil der CD15-CD11b+ Zellen ein Maximum von 20,6% der Gesamtzellzahl.
Tabelle 8-10: Einfluß der Gelöstsauerstoff-Konzentration auf den Anteil neutrophiler Zellen an der Gesamtzellzahl
Anteil neutrophiler Zellen (CD15+) an der Gesamtzellzahl Kulturdauer
[ h ] 75% DO 50% DO 25% DO 5% DO
168 (Tag 7) 49,1 51,5 51,5 50,8
216 (Tag 9) 62,9 62,1 61,6 55,9
264 (Tag 11) 63,6 60,67 66,32 53,13
In einem weiteren Versuch wurde der Einfluß des pH-Wertes auf die Proliferation und Differen-zierung humaner neutrophiler Zellen aus CD34+ Zellen untersucht. Die Kultivierung erfolgte ebenfalls unter pH- und pO2-kontrollierten Bedingungen in Mini-Spinner unter Verwendung der cellferm pro Anlage. Die Kultivierungsparameter sind in Tabelle 8-11 angegeben.
Tabelle 8-11: Kulturparameter zur Untersuchung des Einflusses des pH-Wertes auf Proliferation und Differenzierung humaner neutrophiler Zellen aus CD34+ Zellen
Zellen CD34+ Zellen aus CB, 3 Spender
Medium SCGM Medium
Ausgangszelldichte 1·104 Z·mL-1
Wachstumsfaktoren SCF, IL-3, IL-6, G-CSF
Versuchsansätze pH-Wert des Mediums über den CO2-Anteil in der Zuluft geregelt auf pH 6,7
pH 7,0 pH 7,3 pH 7,5
Kultursystem Mini-Spinner, ohne Rührung, auf Schüttelplatte Kulturvolumen 30 mL
Kulturdauer 14 Tage
In dem Versuch ist ein signifikantes Zellwachstum nur in dem auf pH 7,3 geregelten Mini-Spinner (Abbildung 8-15) zu registrieren. In dem Ansatz wird eine Gesamtzell-Expansion um einen Faktor von 67,9 erreicht. Der Vergleich des Immunphänotyps dieser Zellen mit in einer T-Flasche (ungeregelt) kultivierten Zellen zeigt in etwa den gleichen Anteil an neutrophil differen-zierenden CD15+ Zellen an der Gesamtzellpopulation (67% T-Flasche vs. 61% bei kontrollierter Kultivierung). Lediglich der Anteil CD15-CD11b+ Zellen (monozytär differenzierende Zellen) ist beim Mini-Spinner um etwa denselben Betrag erhöht (8% T-Flasche vs. 13% Mini-Spinner). Im Ansatz mit dem Medium-pH-Wert von pH 7,5 zeigen die inokulierten Zellen geringe Proliferati-on. Hier wird nur eine 26fache Expansion der Gesamtzellzahl erreicht. Die beiden auf pH 6,7 und pH 7,0 geregelten Ansätzen zeigen kein signifikantes Wachstum. Die Vitalität Zellen in den Medien mit dem pH-Wert von pH 6,7 und pH 7,0 nimmt deutlich ab, wohingegen die beiden Ansätze mit proliferierenden Zellen Vitalitäten von > 75% aufweisen.
Das ausbleibende Wachstum der Zellen könnte darauf zurückzuführen sein, daß zur Einstellung des pH-Wertes im Medium der CO2-Gehalt in der Gasphase genutzt wurde. Dabei müssen insbesondere für die beiden niedrigen pH-Werte (pH 6,7 und pH 7,0) relativ hohe Gasphasen-CO2-Werte (20-33%) eingestellt werden. Die Modulation des pH-Wertes zu niedrigeren Werten
bringt also auch eine deutliche Erhöhung des pCO2 mit sich. Bei solch hohen CO2-Mengen im Medium ist jedoch nicht auszuschließen, daß inhibitorische oder cytotoxische Effekte eine Rolle spielen und somit ein Wachstum der Vorläuferzellen aus der CD34+ Population unterbleibt.
Andererseits könnte jedoch auch das pH-Fenster innerhalb dessen eine Proliferation der Vorläuferzellen möglich ist, sehr schmal begrenzt sein.
Abbildung 8-15: Einfluß des Medium pH-Wertes auf Gesamtzellzahl und Vitalität bei der Generierung humaner neutrophiler Zellen aus CD34+ Zellen