Tabelle 7-8: Kulturparameter zur Untersuchung der Dosis-Wirkungs-Relation von ATRA Zellen: HL-60, WZB (Teraklin AG)
Ausgangszelldichte: 1·106 Z/mL
Versuchsansätze: Eingestellte ATRA-Konzentrationen im Medium:
Ansatz A: 10 µM Ansatz B: 30 µM Ansatz C: 50 µM Ansatz D: 75 µM
ATRA-Stammlösung gesättigte ethanolische Lösung (8,3mM) Kultursystem: Mini-Spinner
Kulturvolumen: 40 mL
satzweise Kultivierung
Gasfluß: 1 sL/h
Medienparameter: pH = 7,2 Gelöstsauerstoff: 40%DO
In Abbildung 7-9 ist der Verlauf der Zelldichte und der Vitalität von HL-60 Zellen unter Einwir-kung von ATRA gezeigt. Deutlich zeichnen sich die Unterschiede der untersuchten ATRA-Konzentrationen in Bezug auf den Erhalt der Vitalität und des Proliferationsstopps ab. Während die niedrigste ATRA-Konzentration von 10 µM keinen signifikanten Proliferationsstopp hervor-ruft, ist bereits mit der Konzentration von 30 µM nach 48 h Inkubation keine Proliferation feststellbar. Durch Erhöhung der ATRA-Konzentration auf 50 µM kann das Zeitintervall bis zum Proliferationsstopp auf eine Inkubationszeit von 24 h reduziert werden. Allerdings überlagert sich bei längerer Inkubation auch das unvermeidliche Absterben der Zellen, was in einem deutlichen Einbruch in der Vitalität nach 48 h zu erkennen ist. Die weitere Erhöhung der ATRA-Konzentration ist von Nachteil, hier kommen cytotoxische Effekte des Reifungsinduktors zum Tragen, was sich in einem Proliferationsstopp der Zellen und rapiden Abfall der Vitalität ausdrückt. In einem parallel durchgeführten Experiment konnte gezeigt werden, daß der durch die ethanolische ATRA Lösung eingebrachte Alkohol (entsprechend einer Ethanolkonzentration von 0,12 %(v/v)bis 0,9 %(v/v)) sich nicht negativ auf Wachstum oder Vitalität der Zellen auswirkt (Daten nicht gezeigt).
Um die Effektivität der ATRA-induzierten Ausreifung der Zellen zu überprüfen wurden Funktiona-litätsassays durchgeführt. Abbildung 7-10 zeigt repräsentativ den Verlauf der Phagozytose-Kapazität einer vierfachparallel durchgeführten Untersuchung. Die Entwicklung der Phagozyto-se-Kapazität der Zellen hängt neben der ATRA-Konzentration auch von der Inkubationsdauer des Reifungsinduktors ab. So kann bei den ATRA-Konzentrationen von 10 µM
Abbildung 7-9: Zeitabhängige Dosis-Wirkungs-Relation von ATRA: Wachstum und Vitalität
bzw. 30 µM der Anteil phagozytierender Zellen erst nach 70 h ATRA-Inkubation einen Wert von
> 60% der Gesamtzellpopulation erreichen. Dagegen werden bei einer ATRA-Konzentration von 50 µM nach 22,5h und nach 48h der Inkubation die höchsten Phagozytose-Leistungen aller untersuchten Ansätze gemessen. Der cytotoxische Effekt der höchsten ATRA-Konzentration von 75 µM wird auch im Phagozytose-Assay sichtbar, da hier keinerlei Funktionalitätsgewinn der Zellen festzustellen ist. Die Fähigkeit der Zellen, reaktive Sauerstoff-Spezies auf einen extrazellulären mikrobiellen Stimulus hin freizusetzen (Oxidative Burst) entwickelt sich für die ATRA-Konzentrationen von 10 bis 50 µM annähernd ähnlich. Die beiden Ansätze mit 10 und 30 µM erreichen nach 70 Stunden Reifungsdauer die höchste Oxiburst-Kapazität (proportional zu den Chemolumineszenz-Signalen). Der mit 50 µM ATRA versetzte Ansatz erreicht nach 48 h der Reifung seine maximale Oxidative-burst-Kapazität. Entsprechend der abnehmenden vitalen Zellzahl ist das erreichte CL-Signal auch deutlich geringer als bei dem mit 30 µM supplemen-tierten Ansatz und nimmt für noch längere Reifungsdauern weiter ab. Einzig der mit einer Dosis von 75 µM ATRA versetzte Ansatz zeigt auch hier über die gesamte Reifungsdauer keine signifikante Funktionalität.
Abbildung 7-10: Zeitabhängige Dosis-Wirkungs-Relation von ATRA: Phagozytosekapazität der gereiften Zellen
Abbildung 7-11: Zeitabhängige Dosis-Wirkungs-Relation von ATRA: Oxiburst-Kapazität der gereiften Zellen
7.2.2 Medienparameter der Reifung von HL-60
Die Ausreifung der neutrophilen Zellen läuft in vivo im Knochenmark unter hochgradig kontrol-lierten und regukontrol-lierten Bedingungen ab. Für die beiden physiko-chemischen Parameter pH-Wert und Gelöstsauerstoff-Konzentration sind Effekte auf die Granulopoese primärer Zellen be-schrieben. Es ist daher zu erwarten, daß diese Parameter auch auf die Ausreifung der Promyelo-zytenzellinie HL-60 zu funktionalen Zellen einen Einfluß ausüben könnten. Denkbar ist z.B. die Beeinflussung der Reifungskinetik und des Vitalitätserhalts der gereiften Zellen. In technischer Hinsicht gilt es sicherzustellen, daß ein optimaler Sauerstoffgehalt und pH-Wert während der gesamten Reifungsdauer aufrecht erhalten werden kann. Die Ausreifung der HL-60 unter Variation der pH- und Gelöstsauerstoffwerte erfolgte ebenfalls vierfach parallel in Mini-Spinner-Ansätzen mit dem Fermentationssystem cellferm pro. Tabelle 7-9 faßt die Parameter der Reifung zusammen.
Tabelle 7-9: Kulturparameter zur Untersuchung des pH-Wertes auf die ATRA-induzierte Reifung von HL-60
Zellen: HL-60, WZB (Teraklin AG) Ausgangszelldichte: 1·106 Z/mL
Versuchsansätze: Eingestellte pH-Werte im Medium:
Ansatz A: pH 6,7 Ansatz B: pH 7,0 Ansatz C: pH 7,3 Ansatz D: pH 7,5
ATRA-Reifung: 50 µM ATRA im Endansatz
Stammlösung: gesättigte ethanolische Lösung (8,3mM) Kultursystem: Mini-Spinner
Kulturvolumen: 40 mL
satzweise Kultivierung
Gasfluß: 1 sL/h
Medienparameter: Gelöstsauerstoff: 40%DO
Der pH-Wert des Mediums wirkt sich stark auf das Ausmaß der ATRA-Reifung aus. So kann bei einem Medien-pH von 6,7 keine signifikante Funktionalität der Zellen aufgebaut werden.
Oberhalb von pH 7,0 ergeben sich dagegen nur geringe Unterschiede in der Ausprägung der Phagozytose-Kapazität und der Reifungskinetik der HL-60 Zellen. Unter den gegebenen Kulturbedingungen erreichen in allen Ansätzen (pH 7,0; pH 7,3; pH 7,5) mehr als 75% der Zellen ihre Phagozytosekapazität nach 24 Stunden Reifung. In der Staffelung der Medien-pH-Werte von pH 6,7 bis pH 7,5 wächst die mit der Reifung verbundene Oxiburst-Kapazität
deutlich an. So kann mit den bei pH 7,5 gereiften Zellen im Oxiburst-Assay ein mehr als fünffach höheres CL-Signal als mit bei pH 7,0 gereiften Zellen erreicht werden. Das CL-Signal ist proportiolnal zur freigesetzten Menge an ROS (3310 cps (pH 7,5-Zellen) vs. 576 cps (pH 7,0-Zellen)). Die bei pH 7,5 ausgereiften Zellen sind daher in der Lage deutlich mehr biozider ROS zu produzieren.
Interessanterweise wirkt sich der Medien-pH-Wert auch auf die Ausprägung des durch ATRA induzierbaren Proliferationsstopps aus. Abbildung 7-12 zeigt den Verlauf von Zelldichte und Vitalität der HL-60 Zellen unter Einwirkung von ATRA bei verschiednen pH-Werten. Während bei einem pH-Wert von 6,7 das Wachstum sofort eingestellt wird, wachsen die Zellzahlen der bei pH 7,0 und pH 7,3 gereiften Zellen innerhalb der ersten 24 Stunden nach Reifungsindukti-on noch etwa um einen Faktor 2 an. Bei einem Medien pH-Wert vReifungsindukti-on 7,5 tritt unter ATRA-Einwirkung der Proliferationsstopp erst nach 36h ein. Einzig die Medien pH-Werte von pH 7,3 und pH 7,5 erhalten die Vitalität der ATRA-gereiften Zellen auch über einen längeren Inkubati-onszeitraum aufrecht.
Abbildung 7-12: Einfluß des Medien-pH-Wertes auf die ATRA-induzierte Reifung von HL-60
In einem anschließenden Versuch wurden die Gelöstsauerstoff-Konzentrationen im Medium bei sonst gleichen Randbedingungen der Kultivierung variiert. Die eingestellten Gelöstsauerstoff-konzentrationen reichten von 5%DO bis 95%DO. In den Versuchen konnte festgestellt werden, daß der Einfluß der Gelöstsauerstoff-Konzentration auf die Wirkung des ATRAs weniger profund ist als der Medien pH-Wert. Die Zellen aller untersuchten Ansätze erlangten funktionale Reife.
Die gemessenen Werte für Phagozytoseleistung (Anteil der phagozytierenden Zellen an der Gesamtpopulation) und Oxidative-burst-Kapazität liegen im gleichen Größenordnungsbereich, so daß hier keine eindeutige Aussage über eine zu bevorzugende Gelöstsauerstoffkonzentration gemacht werden kann.