Neben der suvh2-GK-Linie wurde auch der Seneszenzverlauf der SUVH2-Überexpressionslinie SUVH2-oe mit dem des WTs verglichen. Abbildung III-10A zeigt jeweils repräsentative Blattrosetten von Pflanzen der SUVH2-oe-Linie sowie des WTs etwa zwei bzw. sechs Wochen nach Aussaat. Des Weiteren sind Blatt fünf bis acht repräsentativer Rosetten für die über den Verlauf des WTs definierten Entwicklungsstadien NS, S0, S1 und S2 abgebildet. Die fotografische Dokumentation der Rosetten und der Blätter fünf bis acht zeigt einen deutlich veränderten Verlauf der Blattalterung in SUVH2 überexprimierenden Pflanzen, unabhängig von einer Verschiebung der Blühinduktion. Sowohl die Betrachtung der gesamten Rosetten als auch der gesondert analysierten Blätter fünf bis acht zeigen ein deutlich späteres Einsetzen des seneszenztypischen Ausbleichens.
Auch für die SUVH2-oe-Linie wurde der Seneszenzverlauf für die Blätter fünf bis acht über die physiologischen Marker Chlorophyllgehalt und PSII-Effizienz im Vergleich zum WT genauer analysiert (Abb. III-10B). Für beide Parameter wurden signifikante Unterschiede zwischen der SUVH2-oe-Linie und dem WT in den untersuchten Seneszenzstadien festgestellt. So verringern sich sowohl der Chlorophyllgehalt als auch die PSII-Effizienzen in der SUVH2-Überexpressionslinie im Vergleich zum WT deutlich später. Die Blätter der SUVH2-oe-Linie erreichen im Durchschnitt um circa eine Woche verzögert das physiologische Alter des WTs im S2-Stadium. Zu diesem Zeitpunkt waren die Blätter fünf bis acht bei den meisten WT-Pflanzen bereits vollständig vergilbt und es konnte keine PSII-Effizienz mehr bestimmt werden. Dieses Stadium, bei dem die Blätter fünf bis acht der SUVH2-oe-Linie physiologisch dem S2-Stadium des WTs entsprachen, wurde als viertes Seneszenzstadium (S3) für die Überexpressionslinie definiert.
Über Expressionsanalysen mittels qRT-PCR wurde außerdem die Stärke der Überexpression von SUVH2 in den vier Seneszenzstadien im Vergleich zur Expression im WT analysiert. Wie in Abbildung III-11 zu erkennen, wird in allen untersuchten Stadien (NS, S0, S1 und S2) deutlich mehr SUVH2-Transkript gebildet als im WT. Weiterhin wurde ein Anstieg des relativen Transkriptgehaltes bereits im S1-Stadium und noch deutlicher im S2 Stadium detektiert. Im S2-Stadium wurde bezogen auf den WT etwa 600-mal mehr Transkript als im NS-S2-Stadium detektiert.
Dies begründet sich teilweise im Absinken der SUVH2-Expression im WT während der Seneszenz
(s. Kapitel III.4.1, Abb. III-7D). Jedoch erklärt dies nur zum Teil den deutlichen Anstieg der Expression von SUVH2. So scheint aus bislang nicht bekannten Gründen die Aktivität des 35S*-Promotors während der Seneszenz zu steigen.
Abbildung III-10: Verlauf der Blattseneszenz von Arabidopsis-Rosettenblättern und die physiologische Charakterisierung der SUVH2-oe-Linie im Vergleich zum WT. (A) Linke Seite: Fotografische Dokumentation der Entwicklung von repräsentativen Arabidopsisrosetten des WTs und der SUVH2-oe-Linie nach zwei und sechs Wochen (Wo).
Rechte Seite: Fotografische Dokumentation repräsentativer Rosettenblätter (fünf bis acht) zu den definierten Entwicklungsstadien NS, S0, S1, S2 und S3 des WTs sowie der SUVH2-oe-Linie. (B) Gezeigt sind die Veränderungen des Chlorophyllgehaltes (linke Seite) bzw. der PSII-Effizienz (Fv/Fm = maximale Quantenausbeute von PSII; rechte Seite) in Abhängigkeit von den definierten Seneszenzstadien. Jeder Datenpunkt entspricht dem Mittelwert (mit entsprechender Standardabweichung als dünne Fehlerbalken dargestellt) von je fünf bis zehn Messungen und vier biologischen Replikaten.
Zudem sind repräsentative Bilder von Blatt sechs sowie entsprechende Fehlfarbenbilder der Imaging-Pam-Analyse für den WT (oberen zwei Reihen) sowie SUVH2-oe (unteren zwei Reihen) gezeigt. Der entsprechende Maßstab ist am rechten Bildrand zur Orientierung dargestellt. Signifikante Unterschiede (zweiseitiger Student t-Test) sind durch Sternchen oder durch Kleinbuchstaben markiert p < 0,05 (*; a), p < 0,01 (**; b), p < 0,001 (***; c). Die Sternchen kennzeichnen Signifikanzlevel zwischen den verschiedenen Seneszenzstadien in Bezug auf das Kontrollstadium (NS) im WT oder entsprechend in der SUVH2-oe-Linie. Kleine Buchstaben kennzeichnen dagegen entsprechend Signifikanzlevel im Vergleich eines Stadiums der SUVH2-oe-Linie bezogen auf den WT.
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Abbildung III-11: Analysen der SUVH2-Expression in SUVH2-oe bezogen auf den WT in der Seneszenzkinetik. Gezeigt ist der relative Transkriptgehalt von SUVH2 für die Entwicklungsstadien NS, S0, S1 und S2, die über qRT-PCR in der SUVH2-oe-Linie bezogen auf den WT ermittelt wurden (verwendetes Primerpaar:
P2.1+P2.2 s. Abb. III-8A). Die Analyse der Daten erfolgte in Bezug auf das Referenztranskript der 18S rRNA anhand der 2-ΔΔCT-Methode (s. Kapitel V.2.5.7.2). Abgebildet sind die Mittelwerte aus drei unabhängigen biologischen Replikaten mit entsprechender Standardabweichung (dunkelgraue dünne Fehlerbalken). Die Expressionsdaten sind logarithmisch aufgetragen.
Insgesamt konnte eine deutliche Verzögerung des Verlaufs der Blattseneszenz für SUVH2 überexprimierende Pflanzen gezeigt werden. Dies bestätigt die Vorversuche, die in einem groben Seneszenzscreening (s. Kapitel III.4) durchgeführt wurden. Da auf physiologischer Ebene kein veränderter Seneszenzverlauf für die SUVH2-knockdown-Pflanzen festgestellt wurde, erfolgten die weiteren Untersuchungen ausschließlich mit der SUVH2-Überexpressionslinie.
III.4.3 Expressionsverhalten von Seneszenzmarkergenen in SUVH2 überexprimierenden Pflanzen.
Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde untersucht, ob und wie die Überexpression von SUVH2 die seneszenzabhängige Genexpression beeinflusst. Dazu wurde zunächst die Expression der zehn Seneszenzmarkergene (s. Kapitel III.1.2) in den fünf definierten Entwicklungsstadien (NS, S0, S1, S2 und S3) mittels qRT-PCR analysiert.
III.4.3.1 Expressionsverhalten von SAG-Markergenen in der SUVH2-oe-Linie.
In Abbildung III-12 sind die Ergebnisse der Bestimmung der relativen Transkriptgehalte für die SUVH2-oe-Linie (blaue Balken) sowie zur besseren Vergleichbarkeit erneut für den WT (dunkelgraue Balken) für die acht SAGs (ANAC019, ANAC083, WRKY6, WRKY53, MYB13, MYB90, SAG12, FRK1) für das nicht seneszente Kontrollstadium (NS) sowie die vier Seneszenzstadien S0, S1, S2 und S3 gezeigt. Für alle der acht analysierten SAGs, ist ein mehr oder weniger stark verändertes Expressionsverhalten in SUVH2 überexprimierenden Pflanzen im Vergleich zum WT zu erkennen. Dabei kommt es bei allen untersuchten Genen zu einem gebremsten oder sogar gänzlich unterdrückten Anstieg der Expression während der Seneszenz. So zeigen SAG12, FRK1 sowie die für TF kodierenden Gene ANAC019, WRKY53, MYB13, MYB90 eine sehr starke Suppression der Induktion während der Seneszenz. Insbesondere die Induktion der Expression für WRKY53 und FRK1 ist auch in fortgeschrittenen Seneszenzstadien (S2 und S3) weitestgehend unterdrückt.
Abbildung III-12: Expression von SAG-Markergenen im definierten Seneszenzsystem für den WT und die SUVH2-oe-Linie. Bestimmung der relativen Transkriptgehalte mittels qRT-PCR für den WT und die SUVH2-oe-Linie in den drei (WT) bzw. vier (SUVH2-oe) definierten Seneszenzstadien S0, S1, S2 und S3, bezogen auf die basalen Transkriptgehalte in der nicht seneszenten Kontrolle (NS), die gleich eins gesetzt wurden. Die Analyse der Daten erfolgte in Bezug auf das Referenztranskript der 18S rRNA nach der der 2-ΔΔCT-Methode (s. Kapitel V.2.5.7.3). Die Daten zeigen die Mittelwerte aus mindestens drei unabhängigen biologischen Replikaten mit entsprechender Standardabweichung als dünne Fehlerbalken.
Signifikante Unterschiede (zweiseitiger Student t-Test) zwischen den analysierten Seneszenzstadien und der Kontrolle (NS)
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sind durch Sternchen markiert p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), p < 0,001 (***). Für jedes Gen sind zudem die Mittelwerte der ΔCT-Werte mit entsprechender Standardabweichung tabellarisch für jedes einzelne Stadium für den WT und die SUVH2-oe-Linie gezeigt. Signifikante Unterschiede (zweiseitiger Student t-Test) zwischen dem WT und der SUVH2-oe-Linie für jedes einzelne Stadium sind durch verschiedene Buchstaben gekennzeichnet [p < 0,05 (a), p < 0,01 (b), p < 0,001 (c)].
Im Vergleich dazu wurde für WRKY6 und ANAC083 nur ein leicht verändertes Expressionsverhalten detektiert. Des Weiteren ergab die Betrachtung der basalen Expression im nicht seneszentem Kontrollstadium (NS) für die SUVH2-Überexpressionslinie im Vergleich zum WT signifikante Unterschiede für die Gene SAG12, FRK1 und MYB13. Wie an den Mittelwerten der ΔCT-Werte, die für das NS-Stadium des WTs sowie der SUVH2-oe-Linie bestimmt wurden, zu erkennen ist, sind die Transkriptgehalte in diesem Stadium in der SUVH2-oe-Linie bereits deutlich höher als im WT. Demnach ist die seneszenzabhängige Induktion zwar kleiner als im WT, allerdings ist dies im Falle dieser Gene vor allem in einem höheren Ausgangslevel der Transkriptmenge begründet. Für die restlichen fünf untersuchten SAGs wurden keine Unterschiede der Expression im NS-Stadium im Vergleich zum WT detektiert.
III.4.3.2 Expressionsverhalten von SDG-Markergenen in der SUVH2-oe-Linie.
Weiterhin wurde das Expressionsverhalten der beiden SDGs RBCS und RPS17 in der SUVH2-oe-Linie analysiert. In Abbildung III-13 sind die Ergebnisse der Bestimmung der relativen Transkriptgehalte für die SUVH2-oe-Linie (blaue Balken) sowie zur besseren Vergleichbarkeit erneut für den WT (dunkelgraue Balken) für das nicht seneszente Kontrollstadium (NS) sowie die vier Seneszenzstadien S0, S1, S2 und S3 gezeigt.
Abbildung III-13: Expression von SDG-Markergenen im definierten Seneszenzsystem für den WT und die SUVH2-oe-Linie. Bestimmung der relativen Transkriptgehalte mittels qRT-PCR für den WT und die SUVH2-oe-Linie in den drei (WT) bzw. vier (SUVH2-oe) definierten Seneszenzstadien S0, S1, S2 und S3, bezogen auf die Transkriptgehalte in der nicht seneszenten Kontrolle (NS), die gleich eins gesetzt wurden. Die Analyse der Daten erfolgte in Bezug auf das Referenztranskript der 18S rRNA nach der der 2-ΔΔCT-Methode (s. Kapitel V.2.5.7.3). Die Daten zeigen die Mittelwerte aus mindestens drei unabhängigen biologischen Replikaten mit entsprechender Standardabweichung als dünne Fehlerbalken.
Signifikante Unterschiede (zweiseitiger Student t-Test) zwischen den analysierten Seneszenzstadien und der Kontrolle (NS) sind durch Sternchen markiert p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), p < 0,001 (***). Für jedes Gen sind zudem die Mittelwerte der ΔCT-Werte mit entsprechender Standardabweichung tabellarisch für jedes einzelne Stadium für den WT und die SUVH2-oe-Linie gezeigt. Signifikante Unterschiede (zweiseitiger Student t-Test) zwischen dem WT und der SUVH2-oe-Linie für jedes einzelne Stadium sind durch verschiedene Buchstaben gekennzeichnet [p < 0,05 (a), p < 0,01 (b)].
Im Gegensatz zu den SAGs zeigen die beiden untersuchten SDGs kaum oder nur leichte Veränderungen ihres seneszenzabhängigen Expressionsverhaltens. Insbesondere die Expression von RPS17 zeigt keine Beeinflussung der Repression während der Seneszenz durch die Überexpression von SUVH2. Auch RBCS wird bereits in der frühen Phase der Seneszenz (S0-Stadium) sowohl im WT als auch in der SUVH2-Überexpressionslinie herunterreguliert. Allerdings verläuft diese Repression erkennbar verzögert in der SUVH2-oe-Linie ab.
Zusammenfassend zeigte sich, dass die acht untersuchten SAGs in Übereinstimmung mit der beobachteten verzögerten Seneszenz in der SUVH2-Überexpressionslinie nicht oder nur deutlich verzögert induziert werden. Interessanterweise ist die Expression für einen Teil dieser SAGs jedoch in nicht seneszenten Blättern der SUVH2-oe-Linie deutlich im Vergleich zum WT verstärkt. Die Expression der beiden untersuchten SDGs verhält sich dagegen ähnlich zum Wildtyp.
III.4.4 Untersuchungen des Chromatins in Interphasekernen SUVH2 überexprimierender Pflanzen während der Seneszenz.
Sowohl auf physiologischer als auch auf Ebene der Expression bekannter SAG- und SDG-Markergene konnte ein seneszenzverzögernder Effekt der Überexpression der putativen Histonmethyltransferase SUVH2 gezeigt werden. Im Folgenden sollte überprüft werden, ob die Chromatinveränderungen, die sowohl auf globaler als auch lokaler Ebene während der Seneszenz für den WT festgestellt wurden (s. Kapitel III.2 und III.3) in der SUVH2-oe-Linie beeinflusst sind.
III.4.4.1 Globale Chromatinveränderungen während der Seneszenz in Interphasekernen der SUVH2-oe-Linie.
Zunächst erfolgte die Analyse der globalen Chromatinstruktur in Interphasezellkernen von Blättern der SUVH2 überexprimierenden Pflanzen in den verschiedenen Entwicklungsstadien. Innerhalb dieser Arbeit wurden dabei wie für den WT (s. Kapitel III.2) verschiedene Chromatinmodifikationen, die entweder euchromatische oder heterochromatische Regionen kennzeichnen, untersucht. Nachfolgend sind die Ergebnisse der globalen Analysen für die mit transkriptionsaktivem Chromatin assoziierten Histonmodifikationen H3K4me2 und H3K4me3, sowie für die beiden repressiven Modifikationen H3K9me2 und H3K27me3 beschrieben.
Zusätzlich erfolgte die allgemeine mikroskopische Beobachtung der Chromatinstruktur hinsichtlich der Chromozentren sowie der Nukleoli für die SUVH2-Überexpressionslinie im Verlaufe der Blattseneszenz analog zu den Analysen im WT.
III.4.4.1.1 Verteilungsmuster euchromatischer Histonmodifizierungen in Interphasekernen