122 - MATERIAL & METHODEN -
- MATERIA L & METH ODEN - - MATERIA L & METH ODEN -
V.1.7 Nährmedien für Escherichia coli
Die Anzucht der Bakterien erfolgte entweder in Flüssigkultur in LB-Medium (1 % (w/v) Bacto®trypton, 0,5 % (w/v) Bacto®yeast extract, 1 % (w/v) NaCl, pH 7) oder auf LB-Agarplatten (LB-Medium plus 1,5 % (w/v) Agar-Agar). Nach dem Autoklavieren und Abkühlen erfolgte gegebenenfalls die Zugabe von Selektionsagenzien:
Antibiotika: 0,24 % (v/v) Ampicillin-Stammlösung (50 mg/ml); 0,3 % (v/v) Tetrazyklin-Stammlösung (5 mg/ml);
Blau-Weiß-Screening: 12 % (v/v) X-Gal-Stammlösung (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid; 20 mg/ml gelöst in Demethylformamid).
V.1.8 Kulturmedien für die Anzucht von Arabidopsis
Arabidopsis-Samen wurden zunächst auf einem Festmedium nach (Murashige und Skoog (1962) zur Keimung gebracht, dieses enthielt 4,4 g/l MS-Salze (DUCHEFA); 8 g/l Agar-Select (GIBCO BRL) sowie 30 g/l Saccharose. Für die Selektion von hetero- bzw. homozygoten suvh2-GK-Pflanzen wurde das Antibiotikum 1 % (v/v) Sulfadiazin-Stammlösung (7,5 mg/ml) zugegeben. Obwohl das Überexpressionskonstrukt der SUVH2-oe-Linie eine Kanamycin-Resistenzkassette beinhaltet, erfolgte die Anzucht der heterozygoten Pflanzen ohne Selektion durch Antibiotika, da aufgrund des starken Kotyledonenphänotyps Überexpressionspflanzen eindeutig von WT-Pflanzen unterschieden werden konnten. Nach etwa einer Woche wurden die Keimlinge der Arabidopsispflanzen auf ein Gemisch aus drei Teilen Erde (Einheitserde Werkverband, TYP ED 73, pH 6,0) und einem Teil Vermiculit (2-3 mm Körnung, Marmullar, Witten) überführt und dort weiter kultiviert.
V.1.9 Pflanzenmaterial und Saatgut
Die Experimente der vorliegenden Arbeit wurden mit dem Modellorganismus Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.
Ökotyp Columbia-0 (Col-0) durchgeführt. Neben dem Wildtyp (WT) wurden zudem die T-DNA-Insertionslinien GABI-Kat_516A07 (suvh2-GK) sowie eine 35S*::mycSUVH2#5 (SUVH2-oe) untersucht.
Linie suvH2-GK
Die verwendete GABI-Kat_516A07 (Ursprung: pAC161)-Mutante wurde vom Nottingham Arabidopsis Stock Center (NASC) bezogen und trägt 1937 bp nach dem Start-ATG bzw. 2051 bp nach dem TKS eine T-DNA Insertion. Die Selektion von Pflanzen mit hetero- bzw. homozygoter Insertion erfolgte zunächst auf MS-Sulfadiazin-Platten (s. Kapitel V.1.8). Pflanzen mit homozygoter T-DNA-Insertion in SUVH2 wurden mittels PCR, unter Verwendung der in Abbildung VI-9B dargestellten Primerkombinationen, selektiert (Primersequenzen sind im Appendix unter A.8 aufgelistet): Primerkombination 1: spezifisch für das SUVH2-WT-Allel: P3.1 (forward) und P3.2 (reverse) sowie Primerkombination 2: P3.1 und P3.3 (GK_LB_o8409;
spezifisch für die T-DNA). Um die Wahrscheinlichkeit anderer Mutationen zu minimieren, wurden ein Teil des Saatguts auf Erde angezogen und über PCR Pflanzen selektiert, die keine T-DNA-Insertion in SUVH2 aufwiesen. Von diesen Pflanzen wurden Samen gewonnen und als die jeweiligen WT-Kontrollen für die Analysen der suvH2-GK-Linie verwendet. Alle nachfolgenden Experimente erfolgten an den homozygoten Nachkommen.
Linie SUVH2-oe
Die verwendete 35S*::mycSUVH2#5-Linie (SUVH2-oe) ist eine von drei unabhängigen, in der AG von Prof.
Dr. Reuter (MLU Halle-Wittenberg) generierten, SUVH2-Überexpressionslinien, die alle einen mehr oder weniger stark ausgeprägten mini plant Phänotyp aufwiesen und für die die eindeutige Überexpression des SUVH2-Proteins gezeigt werden konnte (Naumann et al. 2005). Für die Erstellung der 35S*::mycSUVH2-Linien wurde die SUVH2-CDS über pGEM-T Klonierung in den binären pBI1.4tr-myc Vektor kloniert und über Agrobacterium tumefaciens vermittelte Vakuum-Infiltration in das Genom von Arabidopsis thaliana Col-0-Pflanzen transferiert. In diesen Pflanzen wird unter Kontrolle des konstitutiven 35S*-CamV (Cauliflower Mosaic Virus)-Promotors, ein myc-SUVH2-Fusionsprotein exprimiert. Die Aktivität des 35S*-Promotors ist dabei durch eine Modifizierung im Vergleich zum 35S-Promotor deutlich um etwa das 40fache reduziert (Mindrinos et al. 1994). Des Weiteren beinhaltet das generierte T-DNA-Konstrukt den Selektionsmarker für Kanamycin (nptII) sowie zwei Bordersequenzen (LB, left border und RB, right border). Für diese Linie ist gezeigt, dass es sich um eine Einfachinsertion der T-DNA handelt. Folgender Insertionsort konnte bestimmt werden: 35S*::mycSUVH2#5-Linie: Chromosom 3; Position 76360; Intergenischer Bereich. Für die SUVH2-oe-Linie erfolgten alle Analysen an zumeist heterozygoten Pflanzen.
V.2 Methoden
V.2.1 Anzuchtmethoden
Für die Anzucht von Arabidopsispflanzen wurden die Samen für 15 s mit 70 % Ethanol versetzt und danach ca.
10 min in Natriumhypochlorit-Lösung (Entkeimungslösung: 9% Natriumhypochlorid-Lösung, 0,5% Tween 20®) inkubiert (kurz schwenken). Nach der Entfernung der Entkeimungslösung folgten mehrere Waschschritte mit sterilem Wasser bis zum Verschwinden des Chlorgeruchs. Anschließend wurden die Samen auf MS-Saccharoseplatten (s. Kapitel V.1.8) verteilt. Für eine Synchronisierung der Keimung wurden die Samen für zwei Tage bei 4 °C abgedunkelt stratifiziert. Im Anschluss erfolgte die Keimung für etwa sieben Tage unter Langtag-Bedingungen (16 h Licht [~150 µE/m2/s] bei ~23 °C und ~60 % Luftfeuchte sowie 8h Dunkelheit bei ~18 °C und
124 - MATERIAL & METHODEN -
~60 % Luftfeuchte) in einer klimatisierten Gewächshauskammer. Die Keimlinge wurden dann einzeln in kleine Töpfe, die mit einem Gemisch aus Erde und Vermiculit gefüllt waren (s. Kapitel V.1.8), überführt und weiter unter den genannten Langtagbedingungen kultiviert.
V.2.2 Ernte des Pflanzenmaterials
Ernte für die Bestimmung des relativen Chlorophyllgehaltes
An jedem Untersuchungszeitpunkt wurden von je fünf bis zehn Pflanzen für jede zu analysierende Linie die Rosettenblätter 5 bis 8 (wobei die Kotyledonen als Blatt 1 bis 2 mitgezählt werden) von der restlichen Pflanze abgeschnitten, separat die Frischmasse bestimmt, in 2 ml Eppendorf Gefäße überführt und direkt in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Proben wurden dann bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert.
Ernte für die Bestimmung der PSII-Effizienz
An jedem Untersuchungszeitpunkt wurden von je fünf bis zehn Pflanzen für jede zu analysierende Linie die Rosettenblätter 5 bis 8 (wobei die Kotyledonen als Blatt 1 bis 2 mitgezählt werden) von der restlichen Pflanze abgeschnitten und auf mit Leitungswasser angefeuchtete MS-Platten gelegt und sofort für die Bestimmung der PSII-Effizienz weiter verwendet.
Ernte für T-DNA-Insertionstest und Northern-Blot-Analysen
16 Tage nach Aussaat wurde die gesamte Blattrosette von je fünf Pflanzen der zu untersuchenden Linien abgeschnitten und separiert sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Proben wurden dann bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert.
Ernte für qRT-PCR, Transkriptionsfaktorplattform- und DNA-Methylierungsanalysen
Zu den physiologisch definierten Zeitpunkten wurden mehrfach je 100mg Blattmaterial (Rosettenblätter 5 bis 8, wobei die Kotyledonen als Blatt 1 bis 2 mitgezählt werden) von der restlichen Pflanze abgeschnitten und sehr schnell in ein 2 ml Eppendorf-Gefäß überführt und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Proben wurden dann bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert. Die
Ernte des Blattmaterials erfolgte dabei jeweils am Morgen immer im gleichen Zeitraum (zwischen 9 und 10 Uhr).
Ernte für immunozytologische Analysen
Zu den physiologisch definierten Zeitpunkten wurde das Blattmaterial (Rosettenblätter 5 und 6, wobei die Kotyledonen als Blatt 1 bis 2 mitgezählt werden) von der restlichen Pflanze abgeschnitten. Von diesen Blättern wurden kleinere Blattstücke jeweils seitlich der Mittelrippe ausgelöst, wobei jeweils nur mittlere Teile des Blattes für die folgenden Analysen verwendet wurde (Abb. V-1).
Ernte für ChIP-Analysen
Zu den physiologisch definierten Zeitpunkten wurden je 1 g Blattmaterial (Rosettenblätter 5 bis 8, wobei die Kotyledonen als Blatt 1 bis 2 mitgezählt werden) von der restlichen Pflanze abgeschnitten und sehr schnell in mit eiskaltem sterilem Wasser gefüllte 50 ml-Zentrifugenröhrchen überführt und für die weiteren Schritte der ChIP verwendet. Die Ernte des Blattmaterials erfolgte dabei jeweils am Morgen immer im gleichen Zeitraum (zwischen 10 und 11 Uhr).
V.2.3 Physiologische Methoden
Für die molekularbiologischen Analysen dieser Arbeit war es notwendig, geeignete Stadien der Blattentwicklung physiologisch zu definieren. In Vorarbeiten wurde dazu der Verlauf der natürlichen Blattseneszenz durch die Bestimmung des relativen Chlorophyllgehaltes und der PSII-Effizienz aller zwei Tage dokumentiert und anhand der erhaltenen Daten fünf verschiedene Stadien der Blattentwicklung definiert. Die Messungen sowie Expressionsanalysen erfolgten an definierten Blättern (Blatt 5 bis 8, wobei die Kotyledonen als Blatt 1 bis 2 mitgezählt werden) für den WT, die Linie SUVH2-oe sowie die Linie suvH2-GK, um die Vergleichbarkeit der Proben untereinander zu gewährleisten.
V.2.3.1 Messung des Chlorophyllgehaltes
Für die Bestimmung des Chlorophyllgehaltes erfolgte die Isolierung der Chlorophylle mittels ammoniakalischer Aceton-Lösung (80 % (v/v) Aceton, 19,5 % (v/v) destilliertes Wasser und 0,5 % (v/v) konzentrierte [25 % w/v]
NH3–Lösung). Zunächst wurde dazu die Frischmasse des Blattmaterials bestimmt und anschließend in ein 2 ml Abbildung V-1: Darstellung repräsentativer Arabidopsis Rosettenblätter (jeweils Blatt 6) unterschiedlicher Entwicklungsstadien. Die weißen Vierecke markieren den Bereich der Blätter, der für die immunozytologischen Untersuchungen verwendete wurde.
Eppendorf-Gefäß in flüssigem Stickstoff eingefroren. Zur Aufarbeitung wurde das Pflanzenmaterial mittels Pistill gemörsert und je nach Frischmasse entsprechend Extraktionsmedium zugegeben. Die spektrophotometrische Bestimmung der Chlorophylle erfolgte mittels HP8452A Diode Array Spektrophotometer (Hewlett Packard, Palo Alto, CA, USA). Die Bestimmung der Chlorophyllkonzentration erfolgte nach Schopfer (1989). Pro Messpunkt und biologischem Replikat wurden die Blätter 5 bis 8 von fünf bzw. zehn Einzelmessungen analysiert. Aus den erhaltenen Werten wurde das arithmetische Mittel mit entsprechender Standardabweichung berechnet.
V.2.3.2 Bestimmung der Chlorophyllfluoreszenz als Maß der PSII-Effizienz
Die Messungen der PSII-Effizienz (= maximale Quantenausbeute des PS II = Fv/Fm = (Fm - Fo)/Fm
erfolgte mithilfe eines Imaging-PAM (Pulse Amplitude Modulated) Chlorophyllfluorometers (Heinz Walz GmbH; www.walz.com). Der dabei bestimmte Parameter Fv/Fm ist ein Maß für die Quantenausbeute der PSII-Zentren. Für die Bestimmung des Fv/Fm wurden die Blätter für 10 min dunkeladaptiert. Die Messungen erfolgten bei Raumtemperatur. Pro Messpunkt und biologischem Replikat wurden die Blätter 5 bis 8 von fünf bis zehn Pflanzen analysiert. Aus den erhaltenen Werten wurde das arithmetische Mittel mit entsprechender Standardabweichung berechnet.
V.2.4 Definition der Entwicklungsstadien über physiologische Parameter
Unter Verwendung der zwei physiologischen Parameter Chlorophyllgehalt und PSII-Effizienz wurden fünf verschiedene Entwicklungsstadien definiert. Dabei wurden vier unterschiedliche Stadien der Seneszenz (S0, S1, S2 und S3), die auf ein Kontrollstadium (NS) bezogen werden sollten, wie folgt charakterisiert: Das Kontrollstadium ist durch einen maximalen Chlorophyllgehalt und eine maximale PSII-Effizienz definiert (beides entspricht maximalen Werten (100 %) als Ausgangspunkt). Im frühen Seneszenzstadium (S0) sinkt der Chlorophyllgehalt um etwa 10 % ab und die Chlorophyllfluoreszenz bleibt gleich. Das mittlere S1-Stadium ist gekennzeichnet durch ein Absinken der PSII-Effizienz um ca. 10 % sowie einen deutlichen Chlorophyllabfall von etwa 50 %. In der späten Phase der Seneszenz (S2) sind die PSII-Effizienz bereits um 50 % und der Chlorophyllgehalt auf etwa 75 % im Vergleich zur Kontrolle (NS) verringert. Das S3 Stadium zeichnet sich durch eine Verringerung der PSII-Effizienz in der Seneszenz verzögerten SUVH2-oe-Linie um 50 % aus, während sie beim WT zu diesem Zeitpunkt bereits 0 % beträgt. Das S3-Stadium der SUVH2-oe-Linie entspricht somit den Parametern des S2-Stadiums des WTs.
V.2.5 Molekularbiologische Methoden
V.2.5.1 Generelle molekularbiologische Methoden
Allgemeine molekularbiologische Methoden wie Arbeiten mit Restriktionsenzymen, Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) oder Transformationstechniken wurden, falls nicht anders erwähnt, nach Sambrook und Russel (2001) sowie Mülhardt (2006) durchgeführt.
V.2.5.2 Amplifikation von DNA-Fragmenten über die Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die Vervielfältigung von Abschnitten erfolgte mittels PCR, unter Verwendung unterschiedlicher DNA-Polymerasen. Es sind dabei hauptsächlich die TrueStart Hot Start Taq DNA Polymerase (Thermo Scientific), die Color Taq DNA Polymerase (Roboklon GmbH) sowie der KAPA HiFi Uracil+ Hot Start ReadyMix (PEQLAB Biotechnologie GmbH) mit den jeweils mitgelieferten Puffern verwendet worden. In Abhängigkeit vom Versuch erfolgte die Bestimmung der optimalen Mg2+-, dNTP- und Primerkonzentrationen. Zudem wurde in Abhängigkeit vom Experiment die eingesetzte Template-Menge, die Anlagerungstemperatur für die Primer sowie die Zyklenanzahl der PCRs individuell angepasst.