Charakterisierung transgener SUVH2-loss-of-function und gain-of-function-Pflanzen

Auf Grund des Absinkens des SUVH2-Transkriptgehalts während der Blattseneszenz (s. Kapitel III.4.1) sowie der Vorergebnisse eines Seneszenzscreenings von SUVH2 überexprimierenden Pflanzen, in dem erste Hinweise auf einen veränderten Verlauf der Blattseneszenz in der AG Humbeck gezeigt werden konnten (s. Kapitel III.4; Tab. III.1), wurden zwei transgene Linien analysiert, bei denen die Expression von SUVH2 entweder verringert oder deutlich gesteigert sein sollte. Beide Linien wurden im Folgenden bezüglich der SUVH2-Expression und des allgemeinen Phänotyps (s. Kapitel III.4.2.1) sowie insbesondere des Seneszenzphänotyps (s. Kapitel III.4.2.2) untersucht.

III.4.2.1 Allgemeine Phänotypisierung von transgenen SUVH2-loss-of-function- und gain-of-function-Pflanzen.

Die verwendete SUVH2 T-DNA Insertionslinie (suvh2-GK) stammt aus der GABI-Kat Sammlung (Kleinboelting et al. 2012) und wurde vom NASC (Nottingham Arabidopsis Stock Centre; line-ID:

GK-516A07) bezogen. Sie trägt wie in Abbildung III-8B gezeigt eine T-DNA-Insertion am 3´-Ende der kodierenden Sequenz von SUVH2 im Bereich der SET-Domäne. An genomischer DNA (gDNA), die aus separaten Keimlingen von Samen des WTs und der suvh2-GK-Linie extrahiert wurde, erfolgte die Untersuchung auf Homozygotie durch qPCR mittels der in Abbildung III-8B dargestellten Primer. T-DNA-Insertionspflanzen, für die ein PCR-Produkt unter Verwendung des T-DNA-homologen Primers P3.3 und des SUVH2-homologen Primers P3.1 gebildet wurde sowie kein Produkt mit den, das Wildtypallel amplifizierenden Primern P3.1 und P3.2 entstand, galten als homozygot. Alle darauf folgenden Analysen an der GABI-KAT T-DNA-Insertionslinie erfolgten an Tochtergenerationen homozygoter Pflanzen.

Des Weiteren wurde eine SUVH2-Überexpressionslinie (SUVH2-oe), die von der AG Prof. Dr.

Reuter (MLU Halle, Institut für Genetik) zur Verfügung gestellt wurde, untersucht. Diese Linie wurde über Agrobacterium tumefaciens vermittelte T-DNA-Transformation in das Genom von Arabidopsis generiert (Naumann et al. 2005; Naumann 2006; sowie Kapitel V.1.9). In Abbildung III-8A ist ein Teil der transformierten T-DNA gezeigt. Dabei ist zu erkennen, dass die kodierende Sequenz unter Kontrolle des konstitutiven 35S* Promotors in Fusion mit einem myc-His tag exprimiert wird.

Zur Überprüfung, ob es sich bei den beiden T-DNA-Insertionslinien SUVH2-oe und suvh2-GK tatsächlich um gain-of-function bzw. loss-of-function Linien handelt, erfolgte die Untersuchung des Expressionsverhaltens von SUVH2 über qRT-PCR an RNA, die 16 Tage nach Aussaat (TNA) aus Rosettenblättern von WT-, homozygoten suvh2-GK- und heterozygoten SUVH2-oe-Pflanzen extrahiert wurde. Für die Analyse der SUVH2-Expression wurde dabei das Primerpaar, das ebenfalls in Abbildung III-8A (P2.1 und P2.2) dargestellt ist, verwendet. In Abbildung III-8C sind die Ergebnisse der Bestimmung der relativen Expression für die transgenen Linien im Verhältnis

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zur Expression von SUVH2 im WT gezeigt. Für die SUVH2-Überexpressionslinie konnte eine im Vergleich zum WT etwa 150fach stärkere Expression nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu wurde für die suvh2-GK-Linie aufgrund der nachgewiesenen homozygoten T-DNA-Insertion keine Expression von SUVH2 erwartet. Dennoch konnten unveränderte Transkriptmengen im Vergleich zum WT detektiert werden. Erneut erfolgte die Überprüfung der SUVH2-Expression mit der C-terminal gelegenen Primerkombination P3.1 und P3.2 (Abb. III-8B), die für den Test auf Homozygotie verwendet wurde. Mit diesem Primerpaar konnte wiederum kein Transkript in der suvh2-GK-Linie nachgewiesen werden. Daraus ließ sich schlussfolgern, dass es wahrscheinlich in den suvh2-GK-Pflanzen zur Bildung eines verkürzten Transkriptes kommt. Dieser Widerspruch sollte nachfolgend über Northern-Blot-Analysen aufgeklärt werden. Im Gegensatz zur Expressionsanalyse über qRT-PCR ermöglicht die Northern-Analyse neben der quantitativen Bestimmung auch die Detektion der Gesamtlänge eines Transkriptes. So sollte überprüft werden, ob in der suvh2-GK-Linie tatsächlich zur Bildung eines verkürzten SUVH2-Transkriptes kommt.

Da SUVH2 im WT nur sehr schwach exprimiert wird, erfolgte dazu zunächst eine Aufreinigung und Anreicherung der mRNA (s. Kapitel V.2.5.6.1). Jeweils 1,35 µg mRNA wurden aus Blättern des WTs, der suvh2-GK-Linie sowie der Überexpressionslinie SUVH2-oe extrahiert und für die Northern-Analysen verwendet. Dabei wurde eine 475 bp große Digoxigenin-markierte Sonde, die homolog zur SUVH2 mRNA ist, verwendet (s. Kapitel V.2.5.7.1). In Abbildung III-8C ist deutlich die 2424 bp lange Bande des SUVH2-Transkriptes für den WT erkennbar. Für die SUVH2-oe-Linie konnte erneut ein deutlich erhöhter Transkriptgehalt nachgewiesen werden. Da in dieser Linie SUVH2 in Fusion mit einem dreifachen myc tag exprimiert wird, ist das detektierte Transkript entsprechend größer als das WT-Transkript. Weiterhin zeigten die Northern-Analysen, dass es tatsächlich zur Bildung eines verkürzten SUVH2-Transkriptes in der Linie suvh2-GK kommt.

Daraufhin sollte die Verteilung des SUVH2-Proteins in Kernen vom WT und der transgenen Linien überprüft werden. Dazu wurden immunozytologische Untersuchungen unter Verwendung eines SUVH2-spezifischen Antikörpers (α-SUVH2; polyklonal) durchgeführt (s. Kapitel V.2.5.11.2). Abbildung III-8D zeigt die entsprechenden Fluoreszenzsignale der Immunozytologie sowie die korrespondierende DAPI-Färbung repräsentativer Kerne des WTs, der SUVH2-oe-Linie sowie der suvh2-GK-Linie. Für den WT ist deutlich die bekannte dominante Assoziation des SUVH2-Proteins mit den heterochromatischen Bereichen der Chromozentren zu erkennen (Naumann et al. 2005; Ay et al. 2014b). Die distinkte Lokalisation des Proteins ist völlig verändert in Kernen der SUVH2 überexprimierenden Pflanzen. Hier scheint das Protein ubiquitär über den gesamten Bereich des Zellkerns verteilt zu sein. Weiterhin konnte für die suvh2-GK-Linie über den SUVH2-spezifischen Antikörper keinerlei Fluoreszenz detektiert werden. Dies spricht für eine völlige oder zumindest stark dezimierte Expression des SUVH2-Proteins. So kommt es zwar zur Bildung eines verkürzten Transkriptes, jedoch nicht zur Expression eines Proteins oder aber zu einem schnellen Abbau des translatierten Proteins.

Abbildung III-8: Charakterisierung der SUVH2-Überexpressionslinie (SUVH2-oe) sowie der T-DNA-Insertionslinie GABI-KAT_516A07 (suvh2-GK). (A) Gezeigt ist die schematische Darstellung der untersuchten SUVH2-Überexpressionslinie (SUVH2-oe). Das Überexpressionskonstrukt setzt sich aus einem dreifachen myc tag sowie der SUVH2 CDS zusammen und steht unter der Kontrolle des 35S* CAmV-Promotors. (B) Grafische Darstellung der Genstruktur der SUVH2 T-DNA Mutante (suvh2-GK). Die Linie enthält zwei Kopien der T-DNA pAC161 (inverse Duplikation), die 1937 bp nach dem Start-ATG, bzw. 2051 bp nach dem TKS innerhalb der SET-Domäne von SUVH2 (AT2G33290), inseriert ist. Die T-DNA ist jeweils von der left border (LB)-Sequenz bzw. der right border (RB)-Sequenz flankiert. Primer: P3.1 = genomischer forward Primer; P3.2 = genomischer reverse Primer; P3.3 = Insert-Primer (T-DNA-Primer: GK_LB_o8409, der sich an der LB der T-DNA anlagert) (C) Analyse der SUVH2-Expression in der SUVH2-oe-Linie (links) sowie in der suvh2-GK-Linie (Mitte) mittels qRT-PCR erfolgte unter Verwendung der in Abb.III-8A/B dargestellten Primerkombinationen P2.1+P2.2 für sowie P3.1+P3.2. Die Analyse der Daten erfolgte in Bezug auf das Referenztranskript der 18S rRNA anhand der 2^-ΔΔCT-Methode (s. Kapitel V.2.5.7.2). Abgebildet sind die Mittelwerte aus drei unabhängigen biologischen Replikaten mit entsprechender Standardabweichung (graue dünne Fehlerbalken). (rechts) Ergebnis der mRNA-Northern-Blot-Analyse unter Verwendung einer Digoxigenin-markierten SUVH2-Sonde (s. Kapitel V.2.5.7.1) für den WT, SUVH2-oe und suvh2-GK. Die

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RNA wurde aus ganzen Rosetten von Pflanzen 16 Tage nach Aussaat (TNA) extrahiert. (D) Gezeigt sind die Immunofluoreszenzbilder repräsentativer Interphasekerne aus Rosettenblättern unter Verwendung eines SUVH2-spezifischen Antikörpers (α-SUVH2) für den WT, SUVH2-oe sowie suvh2-GK. Jeweils links sind die DAPI-Fluoreszenz und jeweils rechts die Immunofluoreszenz zu erkennen. Es ist jeweils ein Größenstandard = 10 µm als dünne weiße Linie gegeben. (E) Repräsentative Arabidopsisrosetten von WT-, heterozygoter SUVH2-oe- sowie suvh2-GK-Pflanzen sechs bzw. 21 TNA.

Demnach kann man davon ausgehen, dass es sich bei der suvh2-GK-Linie zumindest um eine starke knockdown-Linie handelt und die Funktion des SUVH2-Proteins weitestgehend nicht mehr erfüllt werden kann. Im Fortgang der Arbeit sollten die transgenen Pflanzen hinsichtlich ihres allgemeinen Phänotyps untersucht werden. Repräsentative Pflanzen des WTs sowie der beiden transgenen Linien wurden nach sechs und 21 TNA fotografisch dokumentiert und sind in Abbildung III-8E gezeigt. Für die SUVH2-oe-Linie sind die bereits bekannten phänotypischen Veränderungen wie gekräuselte Blattränder (curled leaves), insbesondere der Kotyledonen sowie ein deutlicher Kleinwuchs (Naumann et al. 2005) auffällig. Zudem wurden ebenfalls bekannte Charakteristika wie eine verringerte Schotenausbildung sowie eine reduzierte Fertilität im Vergleich zum WT festgestellt (Daten nicht gezeigt). Alle beschrieben phänotypischen Charakteristika waren dabei in homozygoten SUVH2-oe-Pflanzen stärker ausgeprägt als in heterozygoten Pflanzen (Daten nicht gezeigt). Auf Grund des extrem starken Kleinwuchses der homozygoten SUVH2-Überexpressionspflanzen erfolgten die physiologischen und molekularen Analysen an heterozygoten Pflanzen. Im Gegensatz zur SUVH2-oe Linie, weist die suvh2-GK-Linie keine Unterschiede in der Morphologie der Kotyledonen oder im allgemeinen Pflanzenwuchs auf. Auch andere phänotypische Charakteristika wie Veränderungen in der Schotenausbildung oder der Fertilität waren hier unauffällig im Vergleich zum WT (Daten nicht gezeigt). Für beide transgene Linien wurden zudem unter den getesteten Langtagbedingungen keine Veränderungen des Blühzeitpunktes oder dem Ausbildungsbeginn der Rosettenblätter bis zum Blühbeginn im Vergleich zum WT festgestellt (Daten nicht gezeigt).

III.4.2.2 Untersuchungen des Seneszenzverlaufs der transgenen Pflanzen.

Neben der allgemeinen phänotypischen Analyse wurde insbesondere der Verlauf der Blattseneszenz im definierten System (s. Kapitel III.1.1) der beiden transgenen Linien suvh2-GK und SUVH2-oe untersucht. Wie in Abb. III-1 gezeigt, stellen physiologische Messungen wie die Bestimmung der Chlorophyllfluoreszenz oder des Chlorophyllgehalts geeignete Werkzeuge dar, den Seneszenzverlauf an Blättern zu dokumentieren. Daher erfolgte die genaue Betrachtung sowohl der suvh2-GK-Linie als auch der SUVH2-oe-Linie hinsichtlich der physiologischen Blattalterung im Vergleich zum WT.