Phänotypische Tests

Einzelne exprimierte Merkmale eines Bakteriums bilden in der Summe den sog.

Phänotyp. Die Charakterisierung einzelner Merkmale aus dem Phänotyp erlaubt nach Differenzierung bis zur Speziesebene einen Vergleich der Stämme, der im Idealfall eine Typisierung erlaubt und somit für epidemiologische Fragestellungen nutzbar ist. Bei VTEC werden neben serologischen und biochemischen Methoden auch exprimierte Virulenzfaktoren eingesetzt.

2.7.1.1 Serotypisierung

Aus Untersuchungsmaterial isolierte Mikroorganismen können durch die Bestimmung ihres Serovars vorläufig identifiziert werden. Hierzu werden mit Hilfe bekannter Bakterienspezies hergestellte monovalente Antiseren eingesetzt, die z. B. auf somatische Antigene (O-Antigene) oder gegen auf den Geißeln befindliche Antigene (H-Antigene) gerichtet sind (BRÜCKLER et al., 1991). Die Bestimmung des O157-Antigens in Untersuchungseinrichtungen mittels kommerziell erhältlicher Testkits zur schnellen Identifizierung ist unbedingt getrennt von der Serotypisierung zu sehen.

Die Serotypisierung wird im Mikrotiterverfahren nach Erhitzung der vermehrungsfähigen Zelle zur Freisetzung des hitzebeständigen O-Antigens durchgeführt. Zur Serotypisierung von VTEC werden sowohl O- als auch H-Antigene eingesetzt. Dies ermöglicht eine erste Aussage über wichtige epidemiologische Zusammenhänge.

Hierdurch wurde sowohl das Servar O157:H7 als auch O157:H- als ehemals neuer, hochvirulenter Serotyp im Zusammenhang mit HC (RILEY et al., 1983), als auch weitere häufig mit HC, HUS oder TTP assoziierte Serovare wie O111, O26, O103, O22 und O145 identifiziert. Darüber hinaus wurden noch weitere Serovare im Zusammenhang mit humanen Erkrankungen nachgewiesen. Dies ermöglichte im Zuge der Untersuchungen zum Vorkommen von VTEC bei Tieren und in Lebensmitteln eine Einschätzung des Gefährdungspotentials isolierter VTEC für den Menschen sowie die Einstufung dieses Pathovars als Zoonoseerreger (MOHAMMED et al., 1986;

MONTENEGRO et al., 1990; CAPRIOLI und TOZZI, 1998). Auch die Aufklärung epidemiologischer Zusammenhänge bei Infektionen des Menschen kann durch eine Serotypisierung erleichtert werden. Bei regional gehäuft vertretenen Serovaren, wie dem Serovar O157, ermöglicht die Serotypisierung jedoch nur eine vorsichtige Aussage über epidemiologische Zusammenhänge. Hier ist eine ausreichende Differenzierung der Isolate nur durch den Einsatz weiterer Methoden möglich.

TAMURA et al. (1996) konnten durch Serotypisierung sämtlicher in Asien zwischen 1958 und 1992 eingesandter E. coli eine Kategorisierung in einzelne Pathogruppen vornehmen. Anders jedoch als bei den ETEC oder auch weiten Teils bei den EPEC ließ sich eine endgültige Einordnung in die Gruppe der VTEC bzw. EHEC nur durch Bestimmung der Virulenzfaktoren VT oder das das Intimin kodierende eae-Gen vornehmen. Eine eindeutige Korrelation des Serotyps mit der Pathogruppe ließ sich nur bei den „klassischen“ EHEC-Serovaren O157:H7 und O157:H^- nachweisen.

Einschränkend ist hierzu jedoch zu bemerken, daß auch zur Gruppe der EPEC gehörende Serovare wie O157:H39 bei dieser Gruppierung zur Gruppe der EHEC gezählt werden müßten.

Es ist aus epidemiologischer Sicht eine serologische Bestätigung und gegebenenfalls Feindifferenzierung anzustreben (BÜLTE et al., 1998). Diese so erhobenen Daten geben wichtige Hinweise auf die anzuwendende Diagnostik. So ist es beispielsweise in Nordamerika, Großbritannien wie auch im asiatischen Raum möglich, bei der Untersuchung auf das Serovar O157 einen überwiegenden Teil der Krankheitserreger zu erfassen (GRIFFIN, 1998; SPIKA et al., 1998; SMITH et al., 1998). Anders stellt sich die Situation in Kontinentaleuropa und speziell in Deutschland dar, wo das Serovar O157 bei den HUS-Fällen in den letzten Jahren zwar noch eine erhebliche Rolle spielte, jedoch bei den Enteritis-Fällen unabhängig von der Schwere des Verlaufs einen prozentual immer geringeren Anteil ausmachte (BOCKEMÜHL et al., 1996,1997 und 1998; BEUTIN et al., 1994b und 1996b). Hier kann die Bestimmung des Serovars allein bereits wichtige Zusammenhänge aufklären, insbesondere wenn es sich um selten vorkommende handelt. Grundsätzlich kann die Serotypisierung allein nur schwerlich als maßgebliche Methode zur Subtypisierung gewertet werden.

2.7.1.2 Phagentypisierung / Lysotypie

Die Lysotypie basiert auf dem Prinzip, daß Bakteriophagen durch strenge Wirtsspezifität und mit einer hohen Reproduzierbarkeit definierte Wirtszellen infizieren und somit in Kultur zur Lyse bringen. Durch den Einsatz verschiedener definierter Bakteriophagen kann eine Differenzierung der Isolate vorgenommen werden. AHMED et al. (1987) beschrieben ein Schema zur Typisierung von E. coli O157:H7 basierend auf 16 verschiedenen Bakteriophagen, das eine Differenzierung in 14 verschiedene Lysotypen erlaubte. Dieses Schema wurde in der Folge zur Differenzierung auf 62 verschiedene Lysotypen ausgedehnt (KHAKHRIA et al., 1990). Nach neueren Daten beläuft sich die Zahl der verschiedenen Lysotypen auf 82 (WILLSHAW et al., 1997;

STROCKBINE et al., 1998).

Diese Methode wurde zur Aufklärung verschiedener Lebensmittelinfektionen mit VTEC/EHEC eingesetzt (u. a. REIDA et al. 1994; CDC, 1994; BARRETT et al., 1994;

GALLIEN et al. 1997a), wobei sie z.T. den molekularbiologischen Methoden überlegen war (CDC, 1994). Auch im Rahmen epidemiologischer Surveillance-Studien konnten klonale Zusammenhänge bestätigt werden (FROST et al., 1989; FROST et al., 1993).

KRAUSE et al. (1996) wiesen bei der Untersuchung von 124 E. coli O157:H7-Stämmen nach, daß die Lysotypie im Vergleich zur PFGE eine geringere Diskriminierung aufwies.

LIESEGANG et al. (2000) werten die Lysotypie neben der Makrorestriktionsanalyse mit Pulsfeldgelelektrophorese und dem P-Gen Profil als eine weitere hilfreiche Methode für eine erste Einordnung der Isolate, die jedoch für eine ausgedehnte epidemiologische Surveillance nicht genügend differenziere. Sie bewerteten die Lysotypie als hilfreiche Methode zur Analyse der Isolate aufgrund ihrer einfachen und schnellen Durchführbarkeit, die gerade bei Untersuchungen im Zusammenhang mit Erkrankungen eine schnelle erste Einordnung erhobener Befunde erlaube.

Problematisch wird die Interpretation beim Nachweis häufig auftretender Lysotypen, wie z. B. des Phagentyps 2 im Vereinigten Königreich (WILLSHAW et al., 1997; FROST et al., 1989 und 1993) oder des Phagentyps 14 in Kanada (STROCKBINE et al., 1998).

Hier war der Einsatz weiter diskriminierender Methoden wie z. B. der RFLP oder der PFGE notwendig, um klonale Zusammenhänge basierend auf den erhobenen Daten nachweisen zu können.

2.7.1.3 Biotypisierung

Das Prinzip der Biotypisierung ist die Klassifizierung einzelner Stämme einer Spezies nach definierten biochemischen Mustern, gekennzeichnet durch die Fähigkeit oder das Unvermögen, Kohlenhydrate zu verstoffwechseln. Zudem kann bei Bakterien, wie Enterobacteriaceae das Vermögen, die Kohlenhydrate aerob oder anaerob umzusetzen, differenziert werden. ALEKSIC et al. (1992) erarbeiteten anhand von 39 E. coli O157-Stämmen, ein Schema zur Biotypisierung. Hierbei bewerteten sie β-Glucuronidase-Aktivität sowie das Fermentationsverhalten von Sorbitol, Dulcitol, Rhamnose, Raffinose und Saccharose. Dies ergab eine Differenzierung in 11 verschiedene Biovare innerhalb des Serovars O157. Solche Unterschiede im Fermentationsverhalten von E. coli O157:H7-Stämmen konnten RATNAM et al. (1988) nicht feststellen. In ihren Untersuchungen waren 174 Stämme zu 100 % in der Lage, Rhamnose und Dulcitol zu fermentieren. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu der Gruppe der non-O157:H7-Stämme, die typisch für E. coli in allen biochemischen Reaktionen waren. BOCKEMÜHL et al. (1992) konnten für die Gruppe der non-O157-Stämme nicht die Ergebnisse von ALEKSIC et al. bestätigen, bei der Untersuchung von 64 Stämmen wurde nur in einem Fall das Unvermögen, Sorbitol zu fermentieren, festgestellt. Die Möglichkeit zur Differenzierung isolierter O157-Stämme anhand ihrer biochemischen Charakteristika wurde in der Vergangenheit nur vereinzelt bei der Untersuchung lebensmittelbedingter Infektionen genutzt (KRISHNAN et al., 1987;

REIDA et al., 1994; GALLIEN et al., 1997a). Sie stellt nach CHAPMAN (1994) eine zusätzliche Differenzierungsmöglichkeit bei epidemiologischen Untersuchungen dar.

2.7.1.4 VT-Phänotyp

Die Untersuchung auf phänotypische Expression der Subtypen der Verotoxine (Typ 1 und 2) stellte sehr frühzeitig eine schnelle und einfach durchzuführende Methode zur ersten Charakterisierung der Isolate dar. Neben der VT-Neutralisation im Verozelltest, kann diese Subtypisierung auch von Routinelaboratorien mit verschiedenen immunologischen Methoden wie ELISA, Immunoblot oder VTEC-RPLA durchgeführt werden. Sie liefert gemeinsam mit anderen Methoden wichtige zusätzliche Informationen (STROCKBINE et al., 1998). Limitiert ist ihr Einsatz als alleinige Technik zur Subtypisierung allerdings durch den Nachweis drei möglicher VT-Phänotypen VT1, VT2 oder VT1/VT2. Der Nachweis der einzelnen Verotoxine gibt im Rahmen

epidemiologischer Studien Aufschluß über die Häufigkeit des Auftretens der einzelnen VT-Genotypen und läßt eine mögliche Risikoabschätzung für den Verbraucher zu (BOCKEMÜHL et al., 1998).

Die Subtypisierung der VT2-Gruppen kann ein sehr brauchbarer Marker sein (WILLSHAW et al., 1997), jedoch ist hierfür nach derzeitigem Stand der Technik der Einsatz molekularbiologischer Methoden notwendig.