Genotypische Nachweisverfahren

Im Unterschied zu den phänotypischen Nachweisverfahren basiert das Prinzip der genotypischen Nachweisverfahren auf der Identifizierung und Isolierung der gesuchten Pathovaren anhand der Detektion spezifischer Genloci. Die beiden am häufigsten eingesetzten Methoden sind die Polymerase-Kettenreaktion und die DNA-Hybridisierung. Sie sind für die gesamte Gruppe der VTEC einschließlich der EHEC gleichermaßen einsetzbar. Während diese Methoden früher vornehmlich zur weiteren Charakterisierung bereits isolierter Stämme eingesetzt wurden, kommen sie in der Lebensmittelmikrobiologie und –hygiene in zunehmendem Maße als Schnellmethoden zum Nachweis und zur Identifizierung zum Einsatz (SCHUY et al., 1998; GALLIEN et al., 1997b und 1998). Grundsätzlich läuft der Nachweis nach einem Anreicherungs-bzw. Kultivierungsschritt ab, um eine ausreichende Sensivität zu gewährleisten.

2.6.2.1 DNA-Sonden-Technik

Bei dieser Nachweismethode werden einzelne Genabschnitte mit DNA-Sonden bekannter Nukleotidsequenz hybridisiert. Diese DNA-Sonden sind mit einem Farbstoff oder radioaktiven Isotopen markiert und können dann durch Farbreaktion oder mit Hilfe von Röntgenfilmen den spezifischen Nachweis sichtbar machen. Grundsätzlich ist bei der Wahl der Gensonden zwischen Polynukleotiden und Oligonukleotiden zu unterscheiden. Durch Restriktionsverdau eines Referenzstammes entstandene Nukleotid-Sequenzen von einigen hundert bp Länge entstehen sogenannte Polynukleotide, von denen synthetisch hergestellte Oligonukleotiden von etwa 20 bp Länge unterschieden werden. Polynukleotide können auch bei unbekannter DNA-Sequenz eingesetzt werden, um Homologien verschiedener Bakterienstämme vergleichen zu können, oder, soweit das mittels dieses Polynukleotids produzierte Toxin oder Protein durch Klonierungsversuche bekannt ist, auch zum Nachweis spezifischer Gensequenzen. Die Synthese von Oligonukleotiden setzt die Kenntnis des Zielgens voraus, um dann mittels eines für dieses Gen spezifischen Abschnittes dasselbe nachweisen zu können. Diese Technik wurde zunächst als Koloniehybridisierungsverfahren zur Detektion für VTEC spezifischer Sequenzen eingesetzt, wobei zunächst die genaue Nukleotidsequenz des Zielgens nicht bekannt war. Diese Technik wurde ebenso im Rahmen von Versuchen eingesetzt, die zum Ziel

hatten, einzelne Gene in Vektoren zu transformieren und eine erneute Expression des VT zu erlangen (HUANG et al., 1986; NEWLAND et al., 1985; WILLSHAW et al., 1987). In diesen Fällen wurde die Hybridisierung zunächst zur Bestätigung der Transformation in den Vektor eingesetzt. In der Folge wurden die so entwickelten Polynukleotide, sofern sie spezifisch für die nachzuweisende Sequenz waren, im Rahmen der Diagnostik eingesetzt. So konnten LEVINE et al. (1987) mit Hilfe eines 3,4 kbp großen Fragmentes aus dem 60 MDa-Plasmid von E. coli O157:H7 Stamm EDL933 eine für die untersuchten EHEC-Stämme spezifische DNA-Sonde namens CVD 419 herstellen. Den Einsatz von Polynukleotiden im Rahmen der Routinediagnostik zeigten SCOTLAND et al. (1988), indem sie die von WILLHAW et al.

(1985) für VT1 hergestellte 750 bp lange DNA-Sonde und für VT2 die von der gleichen Arbeitsgruppe publizierte 850 bp lange DNA-Sonde (WILLSHAW et al., 1987) verwendeten. Sie konnten eine gute Übereinstimmung der Ergebnisse zwischen VT-Expression im Verozelltest und dem Nachweis des VT-Gens in der DNA-Sonden-Technik nachweisen. Andere Restriktionsfragmente setzten NEWLAND und NEILL (1988) ein. Auch sie konnten eine sehr gute Übereinstimmung mit der phänotypischen Expression nachweisen, wobei sie zudem die hohe Spezifität dieser Methode durch Untersuchung weiterer Bakterienspezies, die keine VT-Expression hatten, demonstrierten. Diese von diesen Arbeitsgruppen publizierten Polynukleotide wurden in der Folge von weiteren Arbeitsgruppen zur Diagnostik eingesetzt. Sie fanden Anwendung in der Stuhldiagnostik (SERIWATA et al., 1988; SMITH et al., 1991;

RAMOTAR et al., 1995) oder bei der Untersuchung von Lebensmitteln wie auch Kotproben von Rindern (SAMADPOUR et al., 1990; BÜLTE, 1991).

In einem weiteren Schritt wurden auf Basis der bekannten Sequenzen der Verotoxine sowie derer Subtypen Oligonukleotide synthetisiert (KARCH und MEYER, 1989a;

THOMAS et al., 1990). Diese zeichneten sich durch eine ebensolche Spezifität und ein ebensolches breites Einsatzfeld aus, wie die ursprünglich verwandten Polynukleotide.

Auch sie wurden zunächst anhand von Referenzstämmen evaluiert, in der Folge für die Untersuchung verschiedenster Fragestellungen, wie die Verifizierung von Isolaten aus Stuhlproben (GUNZER et al., 1992), aber auch zur Differenzierung einzelner Subtypen des VT2 (THOMAS et al., 1993) eingesetzt.

Der Einsatz dieser Technik wurde im Bereich der VTEC auch zur Diagnostik der weiteren Virulenzfaktoren wie des eae-Gens eingesetzt, wobei sowohl die gesamte Gruppe der verschiedenen Subtypen nachweisbar war (JERSE et al., 1990), oder auch einzelne Subtypen (BEEBAKHEE et al., 1992).

Eine weitere wichtige Indikation war die Bestätigung der durch PCR gewonnenen Amplifikate hinsichtlich ihrer Spezifität. Dies erscheint insbesondere wichtig, wenn durch niedrige Annealing-Temperaturen die Gefahr besteht, durch Mis-Priming Amplifikate zu erhalten, die positive Ergebnisse durch gleiche Länge und damit Position in der Gelelektrophorese vortäuschen. In diesem Fall können die Amplifikate nach Southern Blot auf Membranen gedottet und mit kurzen DNA-Sonden, die innerhalb des Amplifikates liegen, hybridisiert werden, um so die Diagnose weiter abzusichern (KARCH und MEYER, 1989a; SCHMIDT et al., 1994; FRATAMICO et al., 1995) oder auch um eine weitere Differenzierung zu ermöglichen (PATON et al., 1993).

2.6.2.2 Polymerase Kettenreaktion (PCR)

Die PCR ist ein in vitro-Verfahren, mit dem eine gesuchte DNA-Sequenz amplifiziert, d. h. enzymatisch vervielfältigt werden kann. Dazu werden spezifische Primer (Oligonukleotide) benötigt, die das zu amplifizierende DNA-Stück flankieren. Sie funktionieren als Startsignal für eine Taq-Polymerase, ein DNA-synthetisierendes Enzym. Im ersten Schritt der PCR erfolgt eine Denaturierung der doppelsträngigen DNA, um nachfolgend die Anlagerung der Primer an den komplementären DNA-Strang in der Annealing-Phase zu ermöglichen. Diese angelagerten Primer dienen der Taq-Polymerase als Erkennungssequenz, so daß sie den so markierten Genabschnitt in der nun folgenden Elongation verlängert und wieder eine doppelsträngige DNA entsteht.

Diese drei Schritte werden 30 bis 40 mal wiederholt, wodurch eine exponentielle Vermehrung der gesuchten Sequenz erreicht wird. Die amplifizierten DNA-Sequenzen können anschließend gelelektrophoretisch sichtbar gemacht werden. Die Spezifität der PCR kann durch Überprüfung der PCR-Produkte mittels Hybridisierung mit entsprechenden Gensonden oder auch deren Restriktionsverdau mit spezifischen Restritionsenzymen bestätigt werden.

Es wurden von KARCH und MEYER (1989b) degenerierte Primer entwickelt, die über den Nachweis hochkonservierter DNA-Regionen Verotoxin-Gensequenzen nachweisen, die bei allen Verotoxin-Typen vorkommen. Diese Primer wiesen eine über 90%ige Homologie zur nachzuweisenden Zielsequenz auf. Den Unterschieden in den DNA-Sequenzen mußte allerdings durch eine Herabsetzung der Annealing-Temperatur auf 43°C Rechnung getragen werden. Die Überprüfung der PCR führten sie mit Hilfe einer Gensondenhybridisierung mit zwei für stxI A uns stxII A spezifischen DNA-Sonden durch, die innerhalb des Amplifikates lagen. Dieser Tatsache trugen PATON et al. (1993) Rechnung, indem sie vier Primer basierend auf den Ergebnissen von KARCH

und MEYER (1989b) synthetisierten. Sie gaben beide Primerpaare einem PCR-Ansatz zu, und konnten durch die Erhöhung der Annealing-Temperatur auf 47°C eine spezifischere Amplifikation erreichen und falsch positive Ergebnisse bei der Untersuchung von Rinderkotproben weitestgehend ausschließen. Im weiteren wurden auch von anderen Arbeitsgruppen verschiedene Primer entwickelt, die sowohl den Nachweis einzelner Subtypen der VTs ermöglichten, als auch den Nachweis ganzer Gruppen. Auch der Nachweis weiterer Virulenzfaktoren wie das eae-Gen, das das Intimin kodiert, der Nachweis des Enterohämolysins, der bifunktionalen Katalase-Peroxidase, der Serin-Protease oder auch des EAST1 mittels PCR wurden in der Folge beschrieben. Grundsätzlich muß bei der Wahl eines Primerpaares immer darauf geachtet werden, daß zum einen alle gesuchten Sequenzen nachgewiesen werden können, zum anderen aber nicht ungewollte Sequenzen amplifiziert werden. Tabelle 14 enthält eine Übersicht über einige publizierte genotypische Nachweisverfahren für die einzelnen Virulenzfaktoren mittels PCR.

Tabelle 14 Auswahl publizierter Primer für Nachweisverfahren der Verotoxine sowie weiterer Virulenzfaktoren von verotoxinogenen E. coli (VTEC) mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Bezeichnung des Primers

Position im Zielgen Nachweis von Referenz

MK 1/

MK 2

311 – 320

515 – 535 (stx A)

Stx, stx1, stx2 KARCH und MEYER (1989b)

VT1a/

VT1b

1191 – 1210 1301 – 1320

stx1

VT2a / VT2b

426 – 445 752 – 771

stx2

POLLARD et al. (1990)

VTe-a / VTe-b

217 – 236 427 – 446

stx2e JOHNSON et al. (1990)

SLT I-1