PCR-basierte Erregerdiagnostik

Die PCR, die auf einer Vervielfältigung der Nukleinsäuresequenzen der bakteriellen oder viralen DNA (Desoxyribonukleinsäure) bzw. RNA (Ribonukleinsäure) nach zusätzlicher reverser Transkription beruht, ermöglicht den Nachweis schwer zu kultivierender und auch zuvor (unter anderem durch kulturelle Verfahren) nicht nachweisbarer Erreger. Hierdurch werden zunehmend potenziell pathogenen Keime für Infektionen der Atemwege nachgewiesen (Brinkmann et al. 2015). Zur Detektion wird die freie DNA der jeweiligen Bakterien verwendet, die durch phagozytierende Zellen oder durch bakterizide antibiotische Wirkung freigesetzt wurde (Wallet et al., 2009).

Es existieren unterschiedliche PCR-Nachweisverfahren. Zum einen gibt es Verfahren die sich durch die Vervielfältigung einer Nukleinsäuresequenz für einen einzelnen Erreger, die sogenannten „single-target-PCR“, auszeichnen, aber auch die „multiplex-PCR“, welche den Nachweis mehrerer verschiedener Erreger möglich machen (Struelens & de Medonca, 2001; Brinkmann et al., 2015).

Der PCR-basierte Erregernachweis erscheint dann weiterführend, wenn die Patienten bereits antibiotisch (vor-) behandelt wurden. In Studien zeigte sich, dass

der kulturelle Nachweis insbesondere bei den häufigsten Keimen Streptococcus pneumoniae und Haemophilus influenzae schwierig ist, da sich die Keimzahl im bronchialen Sekret unter antibiotischer Therapie schnell reduziert. Ein weiterer Vorteil von PCR-basierter Diagnostik ist, dass keine vitalen Erreger, sondern nur DNA-/RNA-Bruchstücke nachgewiesen werden (Strålin et al., 2006;

Wellinghausen et al., 2009).

1.7. „Multiplex-PCR“- Einsatz bei Patienten mit Sepsis

Bei Patienten mit Sepsis ist die Detektion der pathogenen Erreger als infektiöse Ursache für den gezielten Einsatz der antibiotischen Therapie entscheidend.

Goldstandard ist der kulturelle Nachweis der Bakterien oder Pilze (Leitner et al., 2012; Tschiedel et al., 2012; Wellinghausen et al., 2009).

Die Ergebnisse einer BK liegen durchschnittlich nach 8-36 Stunden vor. Daher wird meist zunächst eine empirische antibiotische Therapie begonnen, die auf der aktuellen Studienlage der häufigsten zur Infektion führenden Erreger beruht. Die frühestmögliche erregerspezifische Therapieanpassung basiert dabei zunächst auf Grundlage des Gramstatus, da dieser als schnellstes feststeht (Struelens & de Mendonca, 2001).

Grundsätzlich gelingt ein kultureller Keimnachweis mittels der BK bei Kindern nur selten (in etwa 5% der Fälle). Speziell wenn diese zuvor mit einem Antibiotikum vortherapiert sind ist ein Nachweis im Rahmen einer Kultur erschwert (Tschiedel et al., 2012). Eine Identifikation mittels kultureller Verfahren ist nicht immer möglich, unter anderem (u.a.) dann nicht, wenn der zu kultivierende Erreger langsam wächst (Struelens & de Medonca, 2001).

Eine neue kommerziell erhältliche Methode zum Nachweis von Erregern stellt das

„multiplex-PCR“-System LightCycler SeptiFast® (SF) dar, dessen Bedeutung zur Detektion von pathogenen Keimen bereits in vorherigen Studien untersucht wurde.

Dabei wurde der Goldstandard Kultur mit der molekularbiologischen Methode sowohl bei Kindern als auch bei Erwachsenen im Rahmen einer Sepsis miteinander verglichen. Hierbei zeigte sich, dass mit dem SF mehr Erreger als mit der Standardkultur nachgewiesen werden können, welches sich ebenfalls im Patientenkollektiv der antibiotisch vortherapierten Patienten abzeichnete (Vince et al., 2008; Tschiedel et al., 2012).

Ein weiterer entscheidender Faktor für eine schnelle zielgerechte Therapie ist die Zeit bis zum Vorliegen des Ergebnisses. Der SF kann noch am selben Tag (nach 6-17 Stunden) ein Ergebnis liefern und hierdurch eine zügige Erreger-gerechte Anpassung der Therapie ermöglichen (Tschiedel et al., 2012). Der SF wurde dazu konzipiert die wichtigsten 20 Sepsis-Erreger zu erfassen (Wallet et al., 2009). Ein simultaner diagnostischer Einsatz scheint bislang vorallem bei Patientin mit einer antibiotischer Vortherapie sinnvoll (Vince et al., 2008).

1.8. „Multiplex-PCR“ Einsatz bei Atemwegsinfekten

Die häufigsten Erreger bei der CAP sind der Streptococcus pneumoniae und der Haemophilus influenzae. Die Kultur ist hier der Goldstandard. Diese ist relativ zeitaufwändig und zeigt hauptsächlich unter einer antibiotischen Therapie eine niedrige Sensitivität.

Der kulturelle Nachweis von Streptococcus pneumoniae und Haemophilus influenzae aus der BAL von Erwachsenen wurde in einer vorangegangenen Studie bei Abdeldaim et al., 2010 mit einem PCR-Verfahren verglichen. Es zeigte sich ein vermehrter Nachweis zugunsten der PCR.

Bei vorheriger antibiotischer Therapie ist der kulturelle Nachweis aufgrund mangelnder vitaler Erreger deutlich erschwert. In der Gruppe der antibiotisch vortherapierten Patienten mit einer CAP zeigte sich dabei eine Abnahme der Häufigkeit der positiven Kulturen aus einer BAL-Probe von 92% auf 55%. Der simultane Einsatz eines PCR-Verfahrens ist dadurch zu befürworten, da dieser nicht auf vitalem Erregermaterial beruht (Abdeldaim et al., 2010). Zusätzlich wurde in einer Pilot-Studie von 2014 der SF als „multiplex-PCR“-Verfahren bei der Anwendung der BAL zur Materialgewinnung bei erwachsenen Patienten mit einer Pneumonie untersucht. In dieser Studie konnten mit dem SF signifikant mehr Keime als mit der Kultur nachgewiesen werden (Baudel et al., 2014).

Pilzinfektionen, wie die Aspergillose nehmen einen hohen Stellenwert „(…) bei Patienten mit hämatologischen Malignomen, anaplastischer Anämie, Myelodysplasie und hämatopoetischer Stammzelltransplantation“ ein. Der mikrobiologische Nachweis aus der BAL mittels Kultur gelingt dabei in ca. 50% der Fälle. Die PCR zum Nachweis der Aspergillus-Spezies zeigte in einer experimentellen Studie bei Hasen eine höhere Sensitivität (90-100%) in der

Diagnostik mittels BAL gegenüber der Kultur, sowohl mit als auch ohne antimykotische Vorbehandlung (Walsh et al., 2011).

Eine erhöhte Anzahl an positiven Ergebnissen konnte in weiteren Studien bei Erwachsenen erhärtet werden. Der Nachweis einer Aspergillus-Spezies aus der BAL konnte auf 39% aller Proben mittels PCR-Verfahren gegenüber dem kulturellen Verfahren mit 23% erhöht werden (Zarrinfar et al., 2013). Zudem konnten mittels „multiplex-PCR“-Verfahren DNA-Fragmente isoliert werden, welche mit einer Azol-Resistenz assoziiert werden können und hierdurch eine Entscheidungsfindung in der antimykotischen Therapie ermöglicht werden (Chong, et al., 2016). Der Einsatz des SF bei der BAL zeichnet sich durch einen schnellen Nachweis einer Aspergillose aus (Steinmann et al., 2009).

Auf Grundlage der bisherigen Ergebnisse war das Ziel dieser retrospektiven Studie die Wertigkeit und den Einsatz des SF im Keimnachweis bei pädiatrischen Patienten mit Pneumonien zu untersuchen und ob dieser einen höheren Nachweis verzeichnen kann.