Universität Duisburg-Essen
Aus der Klinik für Kinderheilkunde III
Wert PCR-basierter mikrobiologischer Diagnostik aus bronchoalveolärer Lavage bei Kindern – eine retrospektive Datenanalyse
I n a u g u r a l - D i s s e r t a t i o n zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin durch die Medizinische Fakultät
der Universität Duisburg-Essen
Vorgelegt von Arkadius Goralski aus Neidenburg (Polen)
2020
Dekan: Herr Univ.- Prof. Dr. med. J. Buer 1. Gutachter: Herr Priv. - Doz. Dr. med. F. Stehling 2. Gutachter: Herr Priv.- Doz. Dr. med. J. Kehrmann Tag der mündlichen Prüfung: 13. Juli 2021
DOI:
URN:
10.17185/duepublico/74771
urn:nbn:de:hbz:464-20210922-120411-2
Alle Rechte vorbehalten.
Teile dieser Dissertation wurden am 18.07.2019 in „Multiplex PCR of bronchoalveolar lavage fluid in children enhances the rate of pathogen detection“
in BMC Pulmonary Medicine 2019 publiziert.
Für meine Eltern Marianna und Waldemar
Goralski
1. EINLEITUNG ... 7
1.1. Atemwegsinfektionen………. 7
1.2. Pneumonie………... 7
1.3. Erregerspektrum………..8
1.4. Sepsis als Komplikation einer Atemwegsinfektion……….. 10
1.5. Erregernachweis bei Atemwegsinfektionen………..11
1.6. PCR-basierte Erregerdiagnostik………. 13
1.7. „Multiplex-PCR“- Einsatz bei Patienten mit Sepsis………. 14
1.8. „Multiplex-PCR“ Einsatz bei Atemwegsinfekten……….. 15
2. MATERIAL UND METHODEN ... 16
2.1. Patientenauswahl ... 16
2.2. Material ... 17
2.3. Datenerfassung ... 19
2.4. Kontamination ... 20
2.5. Statistische Analyse ... 21
3. ERGEBNISSE ... 22
3.1. Patientencharakteristika... 22
3.2. Erregernachweis in der Standardkultur und dem SeptiFast ... 23
3.3. Spektrum der positiven Ergebnisse ... 26
3.4. Patienten unter Immunsuppression ... 29
3.5. Erregerspektrum innerhalb der Patienten unter Immunsuppression ... 31
3.6. Bakteriennachweis nach antibiotischer Vortherapie ... 32
3.7. Bakteriennachweis nach antibiotischer Vortherapie bei immunsupprimierten Patienten ... 33
3.8. Pilznachweis unter antimykotischer Vortherapie ... 33
3.9. Pilznachweis unter antimykotischer Vortherapie bei immunsupprimierten Patienten ... 34
3.10. Erregerspektrum nach antibiotischer und antimykotischer Vortherapie ... 34
3.11. Bakteriennachweis ohne antibiotischer Vortherapie ... 36
3.12. Bakteriennachweis ohne antibiotischer Vortherapie bei immunsupprimierten Patienten ... 37
3.13. Pilznachweis ohne antimykotische Vortherapie ... 37
3.14. Pilznachweis ohne antimykotische Vortherapie bei immunsupprimierten Patienten ... 38
3.15. Erregerspektrum ohne antibiotische und ohne antimykotische Vortherapie 39
4. DISKUSSION ... 40
5. ZUSAMMENFASSUNG ... 50
6. LITERATURVERZEICHNIS ... 51
7. TABELLEN- UND ABBILDUNGSVERZEICHNIS ... 57
8. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ... 60
9. DANKSAGUNG ... 61
10. LEBENSLAUF ... 62
1. Einleitung 1.1. Atemwegsinfektionen
Atemwegsinfektionen zählen bei Kindern zu den häufigsten akuten und chronischen Erkrankungen. Sie stellen mit etwa 25% die häufigste Ursache von ambulanten pädiatrischen Behandlungen dar. So bekommt ein Kind im Durchschnitt circa (ca.) 6 Atemwegsinfektionen pro Jahr (Hansen, 2014). Zu den Atemwegsinfektionen wird die „ambulant erworbene Pneumonie“ (CAP,
„community-acquired pneumonia“) gezählt, welche in Europa eine Inzidenz von 330:100.000 Einwohnern bei Kindern unter 5 Jahren und eine Inzidenz von 145:100.000 Einwohnern bei Kindern unter 16 Jahren zeigt. Sie stellt weltweit eine der führenden Todesursachen bei Kindern dar (Ankermann, 2012).
Besonders im Kindesalter ist mit wiederholten Atemwegsinfektionen zu rechnen.
Dies liegt insbesondere darin begründet, dass durch den hohen sozialen Kontakt in Gemeinschaftseinrichtungen, wie zum Beispiel (z.B.) Kindertagesstätten ein erhöhtes Risiko für Infektionen besteht (Kopp & Vogelberg, 2012).
Allgemein wird zwischen den Erkrankungen der oberen und unteren Atemwege unterschieden. Die anatomische Grenze zwischen beiden stellt der Larynx dar (Brinkmann et al., 2015). Zu den Erkrankungen der unteren Atemwege zählt, wie die Bronchiolitis und Bronchitis auch die Pneumonie (Ankermann, 2012). Bei beiden Entitäten handelt es sich um Schleimhautentzündungen im Bereich der Bronchien. Eine klare Trennung beider wird klinisch getroffen. So gilt, dass sich die Bronchiolitis durch eine Überblähung und endexpiratorische feinblasige Rasselgeräusche manifestiert, während die Bronchitis eine obstruktive Komponente in Form von Giemen und Pfeifen in der Auskultation vorweist. Eine Komplikation beider Krankheitsbilder ist die Pneumonie (Kopp & Vogelberg, 2012).
1.2. Pneumonie
Bei der Pneumonie handelt es sich um eine akut verlaufende Entzündung des Lungenparenchyms, die durch verschiedene Pathogene verursacht werden kann.
Die Pneumonie lässt sich anhand der pathogenen Erreger in eine virale oder bakterielle Form unterteilen. Des Weiteren erfolgt eine Einordnung bezüglich der anatomischen Lokalisation in eine Lobär-, Segment-, Broncho- oder interstitielle Pneumonie (Kopp & Vogelberg, 2012). Die CAP stellt dabei die häufigste Pneumonie bei Kindern dar (Liese, 2013). Von der CAP müssen die nosokomiale
Pneumonie (HAP, „Hospital-acquired pneumonia“) sowie die Pneumonie bei immunsupprimierten Patienten abgegrenzt werden (Ankermann, 2012).
Definitionsgemäß erfolgt dabei die Unterteilung entsprechend der S3-Leitlinie der
„Deutschen Gesellschaft für Pneumologie“. Die „ambulant erworben Pneumonie“
(CAP) wird hierbei definiert als „(…) eine Pneumonie, die durch den Ort des Erwerbs (außerhalb des Krankenhauses) sowie die Immunität des Patienten (Immunkompetenz) bestimmt wird.“ Dem gegenüber steht die nosokomiale Pneumonie „die definiert ist als eine Pneumonie, die > 48h nach Krankenhausaufnahme bzw. bei Patienten mit einer vorbestehenden Hospitalisation bis vor 3 Monaten entsteht. Beide Entitäten sind zu unterscheiden von der Pneumonie unter schwergradiger Immunsuppression. Eine Pneumonie unter schwergradiger Immunsuppression liegt vor, wenn ein von der ambulant erworbenen Pneumonie und HAP abweichendes, typisches, der jeweiligen Art der Immunsuppression entsprechendes Erregerspektrum zu erwarten ist bzw. ein erhöhtes Risiko für sogenannte opportunistische Erreger besteht.“ Es werden hierzu folgende Kriterien herangezogen: Neutropenie (˂ 1000/µl Neutrophile), iatrogene medikamentöse Immunsuppression, Transplantation solider Organe, Stammzelltransplantation, HIV (Humanes Immundefizienz-Virus)-Infektion bzw.
AIDS (englisch: acquired immunodeficiency syndrome; erworbenes Immundefizienzsyndrom), Antikörpermangelsyndrome und angeborene Immundefekte (Ewig et al., 2016).
1.3. Erregerspektrum
Bei der Bronchitis und Bronchiolitis handelt es sich in den meisten Fällen (>90%) um eine virale Infektion. Das Spektrum umfasst vor allem das Respiratorische Synzytial-Virus sowie die Adeno-, Parainfluenza-, Influenza- und Rhinoviren (Kopp
& Vogelberg, 2012). Anhand der bereits erwähnte Gliederung und des Alters lässt sich ein spezifisches Erregerspektrum der Pneumonie darstellen, welches Tabelle (Tab.) 1 zu entnehmen ist. Viren lassen sich bei Kindern unterhalb von 2 Jahren häufiger nachweisen und kommen dabei bei bis zu zwei Drittel der CAP vor (Liese, 2013). Im Schulkindesalter steigt der Anteil der bakteriellen Pneumonien.
Führender Keim ist der Streptococcus pneumoniae. Mitunter steigt auch der Anteil atypischer Erreger wie die Mykoplasmen und Chlamydien (Ankermann, 2012). Zu beachten gilt, dass einige der tabellarisch aufgeführten Keime zur
Standardflora der oberen Atemwege angehören. Diese können z.B. durch Aspiration in die unteren Atemwege gelangen und dort zu einer Entzündungsrektion führen (Kopp & Vogelberg, 2012).
Tabelle 1: Erreger der Pneumonie im Kindesalter (DGPI-Handbuch, 2013)
Pneumonie Bakterien Viren Pilze
Neugeborenen- pneumonie (1.-.28. Lebenstag)
B-Streptokokken, Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeroginosa, Ureaplasma urealyticum
CMV Pneumocystis
jiroveci, Candida spp.
Ambulant erworbene Pneumonie
(3 Wochen – 3 Monate)
Streptococcus pneumoniae,
Staphylococcus aureus, Bordetella pertussis, Chlamydia trachomatis
RSV, Parainfluenzaviren
Ambulant erworbene Pneumonie
(4 Monat – 5 Jahre)
Streptococcus pneumoniae,
Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae
RSV, Parainfluenzaviren, Influenzaviren,
Adenoviren, Rhinoviren
Ambulant erworbene Pneumonie
(> 5 Jahre)
Streptococcus pneumoniae,
Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Haemophilus influenzae
RSV, Parainfluenzaviren, Influenzaviren,
Adenoviren, Masernvirus, VZV
Nosokomiale Pneumonie¹
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Escherichia cloacae (ggf.
3MRGN oder 4MRGN), Staphylococcus aureus, ggf. MRSA, seltener Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus
pneumoniae,
Legionella pneumophila, Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia
RSV, Parainfluenzaviren, Influenzaviren,
Adenoviren, CMV, HSV, VZV
Aspergillus spp.
Aspirationspneumonie Bacteroides spp., Prevotella spp., Peptostreptokokken, Fusobakterien, Streptococcus pneumoniae,
bei noskomialer Ätiologie auch Staphylococcus aureus und gramnegative Bakterien
Pneumonie bei
Immundefizienz
Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa
CMV, VZV, HSV, HHV-6, EBV, Masernvirus
Pneumocystis jiroveci, Aspergillus spp.
CMV: Zytomegalie-Virus, HSV: Herpes-simplex-Virus, RSV: Respiratory-syncytial-Virus, VZV:
Varizella-Zoster-Virus, EBV: Epstein-Barr-Virus, HHV: Humanes-Herpes-Virus, MRGN:
multiresistente gramnegative Bakterien, MRSA: methicillinresistente Staphylococcus aureus, spp.:
Spezies
¹ Die nosokomiale Pneumonie manifestiert sich >48h nach Krankenhausaufnahme
1.4. Sepsis als Komplikation einer Atemwegsinfektion
Die Sepsis hat einen signifikanten Anteil an der Mortalität bei pädiatrischen Patienten. Eine amerikanische Studie ergab, dass die Sepsis bei Kindern in 7%
der Fälle als zum Tode führende Ursache gilt. Pneumonien sind hierbei insbesondere bei älteren Kindern als häufigste Ursache für eine Sepsis erkennbar (Watson et al., 2002). Aufgrund ihres schlechten Outcomes stellt die Sepsis nach wie vor eine der gefürchteten Komplikationen weltweit dar (Reinhart et al., 2013).
Chronische Lungenerkrankungen stellen dabei einen prädisponierenden Faktor.
Insbesondere Patienten mit einem Immundefekt zeigen eine schwere Sepsis unter einem respiratorischen Infekt (Watson et al., 2002). Neugeborene und vor allem die Frühgeborenen zählen, bedingt durch ihr unvollständig ausgebildetes Immunsystem, ebenfalls zu den Risikopatienten (Lucignano et al., 2010).
Im klinischen Alltag spielt die Erkrankung bei immunsupprimierten Patienten, z.B.
im Rahmen eines malignen Geschehens eine entscheidende Rolle (Tschiedel et al., 2012). Ein schneller Nachweis der pathogenen Erreger ist hierbei entscheidend für die Prognose. In Bezug auf die internationalen Richtlinien sollte der nötige Erregernachweis die dringend erforderliche empirische antibiotische
Therapie nicht verzögern (Tafelski et al., 2014). Ebenso ist es sinnvoll immunsupprimierten Patienten eine antibiotische Therapie zur Prävention einer Bakteriämie und möglicherweise hieraus folgender Sepsis zu verabreichen (Lucignano et al., 2011).
Bei schwerkranken Patienten mit einer Infektion - durch Bakterien oder Pilze verursacht - ist eine unverzügliche empirische antibiotische Therapie innerhalb der ersten Stunden entscheidend um die Mortalität zu senken. Der alleinige Verdacht auf eine Sepsis ist zur Entscheidung eines Therapiebeginns ausreichend (Kumar et al., 2006). Dem gegenübergestellt reduziert die antibiotische Therapie oftmals den vitalen Nachweis der Pathogene, welches sich auf das mögliche Ergebnis von Standardkulturen auswirkt (Tafelski et al., 2014).
1.5. Erregernachweis bei Atemwegsinfektionen
Wie in den vorherigen Abschnitten erwähnt haben Viren bei Infektionen der Atemwege bei Kindern einen hohen Stellenwert. Daher ist in Bezug auf den gezielten Einsatz von Antibiotika eine Identifikation der entsprechenden Erreger sinnvoll (Brinkmann et al., 2015). Bei schwerwiegenden Verläufen von Infektionen der unteren Atemwege ist der Nachweis von pathogenen Keimen erstrebenswert, um gezielte Therapien einzuleiten (Strålin et al. 2006). Insbesondere bei hospitalisierten Patienten mit einer CAP sollte aufgrund der erhöhten Komplikationsrate mit signifikanter Letalität eine mikrobiologische Diagnostik durchgeführt werden (Ewig et al., 2016).
Für den entsprechenden Nachweis können Kulturen z.B. aus Sputum angelegt werden. Dabei ist zu beachten, dass es zu einer Kontamination der pharyngealen Flora und somit zu einer Verfälschung der Ergebnisse kommen kann.
Sputumkulturen werden in erster Linie eingesetzt, da Blutkulturen (BK) zum pathogenen Nachweis bei Atemwegsinfekten in Studien eine niedrige Sensitivität zeigen (Strålin et al., 2006). Bei kulturellen Verfahren aus Rachenabstrichen hat ein positiver Nachweis eine geringe Aussagekraft, da diese mit dem eigentlichen Keimspektrum nicht direkt korrelieren (Liese, 2013). Ein positiver Erregernachweis lässt sich nur dann sicher als kausal deklarieren, wenn das gewonnene Material
zum Nachweis aus einem physiologisch sterilen Bereich stammt. Zu solch einem Kompartiment zählen die Atemwege nicht.
Die Materialgewinnung zum Nachweis von Infektionen der unteren Atemwege ist schwierig, da keine nicht-invasive Methode zur Verfügung steht. Proben aus den oberen Atemwegen korrelieren nicht unbedingt mit dem Keimspektrum der unteren Atemwege. Die derzeit einzige Methode zur Gewinnung von Material aus den unteren Atemwegen ist die bronchoalveoläre Lavage (BAL) (Brinkmann et al., 2015).
Die BAL kann im endoskopisch oder nicht-endoskopisches Verfahren durchgeführt werden. Beim endoskopischen Verfahren wird ein flexibles Endoskop bis in die tiefen Atemwege eingeführt, im betroffenen Bronchus sterile Kochsalzlösung appliziert und zur weiteren mikrobiologischen Untersuchung aspiriert. Das endoskopische Verfahren erlaubt eine gezielte Untersuchung des betroffenen Bronchus und ermöglicht dem Untersucher eine Inspektion des Tracheobronchialsystems.
Beim nicht-endoskopischen Verfahren wird ein Katheter blind in einen einliegenden endotrachealen Tubus eingeführt. Das nicht-endoskopische Verfahren findet zumeist Anwendung bei intubierten Kindern oder derer mit diffuser Lungenerkranung (Faro et al., 2015).
Der große Vorteil der BAL ist, dass eine Kontamination durch die pharyngeale Standardflora reduziert werden kann (Strålin et al., 2006). Die BAL findet insbesondere bei schweren Verläufen einer Pneumonie zur Bestimmung von pathogenen Bakterien, Viren oder Pilzen Anwendung (Radhakrishnan et al, 2014). Auch bei Pneumonien immunsupprimierter Patienten, insbesondere wenn eine Aspergillose im Verdacht steht wird eine BAL empfohlen (de Blic et al. 2000).
Die Materialgewinnung mittels endoskopischer Verfahren stellt eine besondere Anforderung an den Untersucher dar, da es sich um ein invasives Verfahren handelt, welches mit möglichen Komplikationen verbunden ist. Die Indikation sollte streng gestellt werden (de Blic et al., 2002).
Um das Risiko von Komplikationen zu senken wird im Vorfeld häufig bereits eine empirische antibiotische Therapie eingeleitet. Ein Erregernachweis ist zur Deeskalation mit spezifischer antibiotischer Therapie zur Optimierung der Wirksamkeit sowie zur Senkung von Nebenwirkungen erstrebenswert (Radhakrishnan et al., 2014).
Die Erregerdiagnostik mittels BAL ist aber durch eine niedrige Sensitivität bei der Gramfärbung sowie beim kulturellen Nachweis nach vorangegenager antibiotischer Therpie gekennzeichnet (Blot et al., 2000, Chastre et al, 2010).
Zudem dauert es bis zum Resultat der Gramfärbung bis zu 12 Stunden und dem des kulturellen Nachweises 24 – 48 Stunden, weshalb die Einleitung einer empirischen antibiotischen Therapie bei Verdacht auf eine Pneumonie trotz fehlendem Erregernachweis unabdingbar ist (de Blic et al., 2000).
Ein mikrobiologischer Nachweis mittels der Polymerasenkettenreaktion (PCR,
„polymerase chain reaction“) wird in der klinischen Routine vor allem durchgeführt, wenn die Erreger schwer zu kultivieren sind wie bei Mykoplasmen oder Chlamydien. Zusätzlich kann der molekularbiologische Errgernachweis unterstützend zum kulturellen Nachweis eingesetzt werden, wenn ein schnelles Ergebniss notwendig ist. Aktuell ist die Wertigkeit von PCR-basierter Erregerdiagnostik bei Infektionen der unteren Atemwege nicht ausreichend geklärt (Brinkmann et al., 2015).
1.6. PCR-basierte Erregerdiagnostik
Die PCR, die auf einer Vervielfältigung der Nukleinsäuresequenzen der bakteriellen oder viralen DNA (Desoxyribonukleinsäure) bzw. RNA (Ribonukleinsäure) nach zusätzlicher reverser Transkription beruht, ermöglicht den Nachweis schwer zu kultivierender und auch zuvor (unter anderem durch kulturelle Verfahren) nicht nachweisbarer Erreger. Hierdurch werden zunehmend potenziell pathogenen Keime für Infektionen der Atemwege nachgewiesen (Brinkmann et al. 2015). Zur Detektion wird die freie DNA der jeweiligen Bakterien verwendet, die durch phagozytierende Zellen oder durch bakterizide antibiotische Wirkung freigesetzt wurde (Wallet et al., 2009).
Es existieren unterschiedliche PCR-Nachweisverfahren. Zum einen gibt es Verfahren die sich durch die Vervielfältigung einer Nukleinsäuresequenz für einen einzelnen Erreger, die sogenannten „single-target-PCR“, auszeichnen, aber auch die „multiplex-PCR“, welche den Nachweis mehrerer verschiedener Erreger möglich machen (Struelens & de Medonca, 2001; Brinkmann et al., 2015).
Der PCR-basierte Erregernachweis erscheint dann weiterführend, wenn die Patienten bereits antibiotisch (vor-) behandelt wurden. In Studien zeigte sich, dass
der kulturelle Nachweis insbesondere bei den häufigsten Keimen Streptococcus pneumoniae und Haemophilus influenzae schwierig ist, da sich die Keimzahl im bronchialen Sekret unter antibiotischer Therapie schnell reduziert. Ein weiterer Vorteil von PCR-basierter Diagnostik ist, dass keine vitalen Erreger, sondern nur DNA-/RNA-Bruchstücke nachgewiesen werden (Strålin et al., 2006;
Wellinghausen et al., 2009).
1.7. „Multiplex-PCR“- Einsatz bei Patienten mit Sepsis
Bei Patienten mit Sepsis ist die Detektion der pathogenen Erreger als infektiöse Ursache für den gezielten Einsatz der antibiotischen Therapie entscheidend.
Goldstandard ist der kulturelle Nachweis der Bakterien oder Pilze (Leitner et al., 2012; Tschiedel et al., 2012; Wellinghausen et al., 2009).
Die Ergebnisse einer BK liegen durchschnittlich nach 8-36 Stunden vor. Daher wird meist zunächst eine empirische antibiotische Therapie begonnen, die auf der aktuellen Studienlage der häufigsten zur Infektion führenden Erreger beruht. Die frühestmögliche erregerspezifische Therapieanpassung basiert dabei zunächst auf Grundlage des Gramstatus, da dieser als schnellstes feststeht (Struelens & de Mendonca, 2001).
Grundsätzlich gelingt ein kultureller Keimnachweis mittels der BK bei Kindern nur selten (in etwa 5% der Fälle). Speziell wenn diese zuvor mit einem Antibiotikum vortherapiert sind ist ein Nachweis im Rahmen einer Kultur erschwert (Tschiedel et al., 2012). Eine Identifikation mittels kultureller Verfahren ist nicht immer möglich, unter anderem (u.a.) dann nicht, wenn der zu kultivierende Erreger langsam wächst (Struelens & de Medonca, 2001).
Eine neue kommerziell erhältliche Methode zum Nachweis von Erregern stellt das
„multiplex-PCR“-System LightCycler SeptiFast® (SF) dar, dessen Bedeutung zur Detektion von pathogenen Keimen bereits in vorherigen Studien untersucht wurde.
Dabei wurde der Goldstandard Kultur mit der molekularbiologischen Methode sowohl bei Kindern als auch bei Erwachsenen im Rahmen einer Sepsis miteinander verglichen. Hierbei zeigte sich, dass mit dem SF mehr Erreger als mit der Standardkultur nachgewiesen werden können, welches sich ebenfalls im Patientenkollektiv der antibiotisch vortherapierten Patienten abzeichnete (Vince et al., 2008; Tschiedel et al., 2012).
Ein weiterer entscheidender Faktor für eine schnelle zielgerechte Therapie ist die Zeit bis zum Vorliegen des Ergebnisses. Der SF kann noch am selben Tag (nach 6-17 Stunden) ein Ergebnis liefern und hierdurch eine zügige Erreger-gerechte Anpassung der Therapie ermöglichen (Tschiedel et al., 2012). Der SF wurde dazu konzipiert die wichtigsten 20 Sepsis-Erreger zu erfassen (Wallet et al., 2009). Ein simultaner diagnostischer Einsatz scheint bislang vorallem bei Patientin mit einer antibiotischer Vortherapie sinnvoll (Vince et al., 2008).
1.8. „Multiplex-PCR“ Einsatz bei Atemwegsinfekten
Die häufigsten Erreger bei der CAP sind der Streptococcus pneumoniae und der Haemophilus influenzae. Die Kultur ist hier der Goldstandard. Diese ist relativ zeitaufwändig und zeigt hauptsächlich unter einer antibiotischen Therapie eine niedrige Sensitivität.
Der kulturelle Nachweis von Streptococcus pneumoniae und Haemophilus influenzae aus der BAL von Erwachsenen wurde in einer vorangegangenen Studie bei Abdeldaim et al., 2010 mit einem PCR-Verfahren verglichen. Es zeigte sich ein vermehrter Nachweis zugunsten der PCR.
Bei vorheriger antibiotischer Therapie ist der kulturelle Nachweis aufgrund mangelnder vitaler Erreger deutlich erschwert. In der Gruppe der antibiotisch vortherapierten Patienten mit einer CAP zeigte sich dabei eine Abnahme der Häufigkeit der positiven Kulturen aus einer BAL-Probe von 92% auf 55%. Der simultane Einsatz eines PCR-Verfahrens ist dadurch zu befürworten, da dieser nicht auf vitalem Erregermaterial beruht (Abdeldaim et al., 2010). Zusätzlich wurde in einer Pilot-Studie von 2014 der SF als „multiplex-PCR“-Verfahren bei der Anwendung der BAL zur Materialgewinnung bei erwachsenen Patienten mit einer Pneumonie untersucht. In dieser Studie konnten mit dem SF signifikant mehr Keime als mit der Kultur nachgewiesen werden (Baudel et al., 2014).
Pilzinfektionen, wie die Aspergillose nehmen einen hohen Stellenwert „(…) bei Patienten mit hämatologischen Malignomen, anaplastischer Anämie, Myelodysplasie und hämatopoetischer Stammzelltransplantation“ ein. Der mikrobiologische Nachweis aus der BAL mittels Kultur gelingt dabei in ca. 50% der Fälle. Die PCR zum Nachweis der Aspergillus-Spezies zeigte in einer experimentellen Studie bei Hasen eine höhere Sensitivität (90-100%) in der
Diagnostik mittels BAL gegenüber der Kultur, sowohl mit als auch ohne antimykotische Vorbehandlung (Walsh et al., 2011).
Eine erhöhte Anzahl an positiven Ergebnissen konnte in weiteren Studien bei Erwachsenen erhärtet werden. Der Nachweis einer Aspergillus-Spezies aus der BAL konnte auf 39% aller Proben mittels PCR-Verfahren gegenüber dem kulturellen Verfahren mit 23% erhöht werden (Zarrinfar et al., 2013). Zudem konnten mittels „multiplex-PCR“-Verfahren DNA-Fragmente isoliert werden, welche mit einer Azol-Resistenz assoziiert werden können und hierdurch eine Entscheidungsfindung in der antimykotischen Therapie ermöglicht werden (Chong, et al., 2016). Der Einsatz des SF bei der BAL zeichnet sich durch einen schnellen Nachweis einer Aspergillose aus (Steinmann et al., 2009).
Auf Grundlage der bisherigen Ergebnisse war das Ziel dieser retrospektiven Studie die Wertigkeit und den Einsatz des SF im Keimnachweis bei pädiatrischen Patienten mit Pneumonien zu untersuchen und ob dieser einen höheren Nachweis verzeichnen kann.
2. Material und Methoden
2.1. Patientenauswahl
Im Rahmen der vorliegenden Studie wurden im Zeitraum von September 2011 bis Mai 2017 bei insgesamt 70 Patienten bestehend aus Kindern und Jugendlichen (34 männlich, 36 weiblich) im Alter von 0 - 25 Jahren mit pulmonalen Infektionen die BAL durchgeführt. Die aspirierte Spülflüssigkeit wurde daraufhin mittels der Standardkultur und dem SF auf mögliche pathogene Keime untersucht. Die BAL erfolgte im Rahmen eines stationären Aufenthaltes am Zentrum für Kinder – und Jugendmedizin über die pneumologische Abteilung der Klinik für Kinderheilkunde III (Leitung Prof. Dr. med. D. Reinhardt) des Universitätsklinikums Essen. Die Patienten wurden während des Aufenthaltes nicht beatmet und waren somit spontanatmend.
Die 70 entnommenen Proben, entsprechend der Patienten, wurden in der vorliegenden Arbeit auf ihren Wert und Relevanz im Hinblick auf die mikrobiologische Diagnostik in der Pädiatrie untersucht.
Die retrospektive Datenanalyse der ausgewählten Patienten wurde durch das lokale Ethikkommitee des Universitätsklinikums Essen nach entsprechender Prüfung genehmigt (15-6499-BO).
2.2. Material
Die Bronchoskopie sowie die BAL wurden nach einem standardisierten flexibel- endoskopischen Verfahren durchgeführt. Dieses erlaubt dem Untersucher einen Einblick auf den zu untersuchenden Bereich der Lunge. Die Lingula und der Mittellappen stellen bei nicht lokalisierten Infektionen aufgrund der kleinsten Fläche innerhalb der Lungenlappen und der damit verbunden höchstmöglichen Aspirationsmenge der Spülflüssigkeit den bevorzugten Untersuchungsort dar. Bei lokalisierten Infektionen wird der zuvor radiologisch oder bronchoskopisch ermittelte veränderte Lungenlappen gewählt. Die BAL wird unter kardiorespiratorischem Monitoring durchgeführt (Midulla & Nenna, 2010).
In der Studie wurde die Bronchoskopie sowie die BAL nach standardisiertem Verfahren entsprechend der Empfehlung der „American Thoracic Society“
ausgeführt (Faro et al., 2015). Nach Einleitung der Sedierung erfolgte der transnasale Zugang mit einem flexiblen Bronchoskop. Nach erster Inspektion der oberen Atemwege, erfolgte eine Lokalanästhesie der Schleimhäute des Larynx mit 0,5ml 1%-igen Lidocain-Spray mittels „spray-as-you-go“-Technik (Kaur et al., 2015). Hiernach erfolgte die Inspektion des Bronchialsystems. Die BAL wurde an der Stelle durchgeführt, an der sich die radiologisch-vermutete Pathologie befand und bei nicht eingrenzbarer Veränderung wurde standartisiert der rechte mittlere Lungenlappen gewählt. Das flexible Endoskop wurde in den ausgewählten Bronchus vorgeschoben. Über den Arbeitskanal wurde 1ml/kg Körpergewicht sterile Kochsalzlösung in den gewählten Bronchus eingebracht. Im Anschluss erfolgte die manuelle Aspiration der eingebrachten Flüssigkeit. Der Vorgang wurde bis zu vier mal wiederholt. Die Proben der BAL wurden einzeln aserviert.
Das gewonnene Material wurde unmittelbar ins mikrobiologische Labor des Instituts für Medizinische Mikrobiologie des Universitätsklinikums Essen (Leitung Prof. Dr. med. J. Buer) transportiert, wo die Testung mittels dem kulturellen und dem PCR-Verfahren erfolgte.
Für den mikrobiellen Nachweis der Mikroorganismen mittels der Kultur wurden feste Nährmedien entsprechend der Qualitätsstandards in der mikrobiologisch- infektiologischen Diagnostik (MiQ) verwendet. Hierbei wurden auch gesonderte Nährböden für die Kultivierung von gramnegativen Bakterien und Hefen (Candida Spezies (spp.)) verwendet. Es wurden allgemein erhältliche Agar-Platten genutzt (Columbia Blood Agar, Columbia Agar with Sheep Blood, Cooked Blood Agar, MacConkey Agar, Brilliance selektive Agar, Malt extract Agar, Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Deutschland).
Bei einer Temperatur von 37 °C wurden die Nährböden bis zu 72 Stunden lang inkubiert. Malzextrakt-Agarplatten wurden zudem bei Raumtemperatur für mindestens 7 Tage inkubiert. Nach jeweils 24 und 48 Stunden Inkubationszeit wurden die Nährböden evaluiert. Dabei wurden im semi-quantitativen Verfahren die Anzahl der herangewachsenen Kolonien ermittelt. Die Identifikation und Resistenztestung der Bakterien erfolgte mittels standardisierten mikrobiologischen Verfahrens unterstützt von der VITEK® MS Massenspektromie und der VITEK® 2 mit der VITEK® 2 AST Karte (Vitek MS; Vitek 2, bioMerieux, Marcy l’Etoile, Frankreich).
Für den mikrogenetischen Nachweis der pathogenen DNA wurde der LightCycler®
SeptiFast (SF) verwendet. Dabei handelt es sich um ein „real-time Multiplex-PCR“- Verfahren, das eine quantitative Analyse der DNA aus 20 verschiedenen Bakterien, Hefe- und Schimmelpilzen ermöglicht.
Der Nachweis beim SF erfolgt in drei Schritten. Zunächst wird die Probe in Form einer mechanischen Lyse vorbereitet. Dabei wird mit Hilfe von Proteasen und Puffern die DNA freigesetzt. Die DNA wird hierdurch von sonstigen Bestandteilen (z.B. Proteinen) getrennt und es wird eine interne Kontrolle zur Probe hinzugefügt.
Im nächsten Schritt wird die DNA unter Verwendung von Primern in drei parallelen Reaktionen für grampositive und gramnegative Bakterien sowie für Pilze vervielfältigt. Die Bestimmung des Genotyps erfolgt durch Schmelzkurvenanalyse mittels einer automatisch durchgeführten Software (SeptiFast Identification Software). Zu den möglichen Genotypen zählen bei den grampositiven Bakterien Staphylococcus aureus, Koagulase-negative Staphylococci, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus spp. (Streptococcus agalacticae, Streptococcus
pyogenes, Streptococcus mitis), Enterococcus faecium und Enterococcus faecalis.
Die gramnegativen Genotypen sind Escherichia coli, Klebsiella (pneumoniae/oxytoca), Serratia marcescens, Enterobacter (cloacae/aerogenes), Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii und Stenotrophomonas maltophilia. Zu den nachweisbaren Pilzen zählen Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida glabrata und Aspergillus fumigatus (LightCycler® SeptiFast, Roche, Mannheim, Deutschland).
2.3. Datenerfassung
Die Patientendaten wurden aus der digitalen Patientenakte entnommen, wo auch die mikrobiologischen Ergebnisse der jeweiligen BAL aus der Kultur und dem SF erfasst worden waren. Das Geburtsdatum, das Geschlecht und die Grunderkrankung der Patienten wurden aus den digitalisierten Arztbriefen im SAP sowie der archivierten Akten entnommen.
Anhand der Grunderkrankung bzw. der Medikamenteneinnahme wurden die Patienten in eine Gruppe immunkompetenter und immunsupprimierter Patienten eingeteilt. Als immunsupprimiert galten diejenigen Patienten, die eine hämato- onkologische Grunderkrankung hatten und unter Chemo-und/oder Strahlentherapie standen, mit Zustand nach (Z.n.) Knochenmark- oder einer soliden Organtransplantation waren, eine immunsuppressive Therapie erhielten oder einen angeborenen Immundefekt hatten.
Eine mögliche vorherige antibiotische oder antimykotische Therapie war den Patientenakten zu entnehmen.
Die Pateinten galten als antibiotisch oder antimykotisch vortherapiert, wenn eine Therapie innerhalb der letzten 24 Stunden vor Durchführung der BAL und entsprechender Probeentnahme stattgefunden hat. Entsprechend dieser Daten erfolgte die Eingruppierung in Patienten mit oder ohne antibiotische/antimykotische Therapie. Bei 3 von 70 Patienten konnte die Datenlage hinsichtlich einer Vortherapie nicht mehr retrospektiv rekonstruiert werden.
2.4. Kontamination
Bei den diagnostizierten Erregern galt zu bedenken, dass der SF für die Diagnostik von pathogenen Erregern innerhalb von BK und nicht primär für die BAL entwickelt wurde (LightCycler® SeptiFast, Roche, Mannheim, Deutschland) und somit ein anderes Keimspektum abdeckt. Daher wurde eine mögliche Kontamination nach Auswertung der positiv ermittelten Erreger berücksichtigt. So wurden diejenigen Bakterien und Pilze in die Auswertung nicht miteinbezogen und als Kontamination gewertet, die der oropharyngealen Standartflora angehören und diejenigen die nicht zum pathogenen Keimspektrum sowohl bei der CAP als auch bei der HAP zuzurechen sind. Zu diesen zählen unter anderem die vergrünenden (viridans) Streptokokken, Neisserien, Corynebakterien, Staphylococcus epidermidis, Entercoccus faecalis et faecium und weitere koagulase-negative Staphylokokken sowie die Candida spp. (Ewig et al., 2016, Dalhoff et al., 2017).
Das Erregerspektrum ist der Tab. 2 zu entnehmen. Die genannten Erreger wurden dementsprechend auch nicht bei den Ergebnissen der Kultur gewertet.
Tabelle 2: Häufige und seltene Erreger ambulant erworbener Pneumonien bei Diagnostik aus dem Sputum. *Haemophilus parainfluenzae kann in seltenen Fällen Erreger der ambulant erworbenen Pneumonie sein (S3-Leitlinie Behandlung von erwachsenen Patienten mit ambulant erworbener Pneumonie und Prävention – Update 2016)
Häufige und mögliche Erreger Seltene Erreger Keine Erreger - Streptococcus pneumoniae
- Haemophilus influenzae - Staphylococcus aureus
- Enterobakterien (Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis)
- Pseudomonas aeruginosa
- vergrünend wachsende Streptokokken
- Staphylococcus epidermidis und andere koagulase- negative Staphylokokken - Enterokokken
- Corynebakterien
- Neisserien (außer (sehr selten) Neisseria meningitidis) - Haemophilus spp. (außer Haemophilus influenzae)*
- Candida spp.
2.5. Statistische Analyse
Alle Daten wurden mit dem Tabellenkalkulationsprogramm Excel von Windows®
erfasst. Nach Verschlüsselung erfolgte die Datenanalyse. Dazu wurde die Statistik-Software der IBM® SPSS® Statistics in der Version 24.0. verwendet.
Zur Erfassung der Häufigkeiten wurden deskriptive Verfahren verwendet. Für die Darstellung der Patientencharakteristika, zu denen das Alter und Geschlecht zählen, wurde der Mittelwert, das Minimum und Maximum sowie der Median bestimmt. Ebenso wurden für die positiven als auch negativen Ergebnisse in der Kultur und dem SF, die Diagnosen und antibiotische wie auch antimykotische Vortherapie die deskriptive Datenanalyse in Form der Häufigkeit gewählt.
Für die Auswertung der dichotomen Variablen wurde eine Kreuztabelle ermittelt.
Innerhalb dieser wurde der McNemar-Test für die Zusammenhänge der entsprechenden Dichotomien durchgeführt. Die Ergebnisse wurden als statistisch signifikant angenommen, wenn eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 vorlag.
Für den Grad der Übereinstimmung der Ergebnisse der beiden Testverfahren (Kultur und SF) wurde der Kappa-Koeffizient nach Cohen (ᴋ) in der jeweiligen Kreuztabelle ermittelt. Die Interpretation der Werte für ᴋ erfolgte entsprechend der Richtwerte in Tab. 3 (Grouven et al. 2007).
Tabelle 3: Richtwerte zur Interpretation von ᴋ (nach Altman)
Wert von ᴋ Stärke der Übereinstimmung
< 0,20 schwach
0,21 – 0,40 leicht
0,41 – 0,60 mittelmäßig
0,61 – 0,80 gut
0,81 – 1,00 sehr gut
3. Ergebnisse
3.1. Patientencharakteristika
Die Geschlechterverteilung ergab eine Verteilung von 34 männlichen und 36 weiblichen Patienten (n =70). Die Spannweite des Alters der 70 Patienten betrug 0 – 25 Jahre. Das mittlere Alter lag bei 7,29 ± 6,15 Jahren. Im Median waren es 6,0 Jahre. Über 70% der Patienten waren zum Zeitpunkt der Probeentnahme unter 10 Jahre alt.
n = 70
29 6
6
10 3
5
11
0 5 10 15 20 25 30 35
Hämatoonkologische Erkrankungen
Z.n.
Knochenmarkstransplantation Z.n. Organtransplantation chronische Lungenerkrankung neuromuskuläre Erkrankung Sonstige Ohne chronische Erkrankung
Anzahl
Abbildung 1: Spektrum der Grunderkrankungen der Patienten zum Zeitpunkt der BAL
Die Grunderkrankungen der Patienten sind in der Abbildung (Abb.) 1 dargestellt.
29 Patienten (41,4%) hatte eine Diagnose aus dem Kreis der hämato- onkologischen Erkrankungen. Eine chronische Lungenerkrankung wiesen 10 Patienten (14,3%) auf, welches die zweithäufigste Grunderkrankung darstellt. 11 Proben (15,7%) stammen von Patienten ohne chronische Vorerkrankung.
Insgesamt 59/70 (84,3%) der Patienten wiesen eine vorherige Grunderkrankung auf.
Der Gruppe Immunsuppression waren 41/70 (58,6%) zuzuordnen, eine antibiotische oder antimykotische Vortherapie erfolgte bei 36/70 (51,4%) Patienten. Die gesamten Patientencharakteristika sind der Tab. 4 zu entnehmen.
Tabelle 4: Patientencharakteristika Grunderkrankung Patienten
(Anzahl)
Geschlecht [Anzahl]
W: weiblich M: männlich
Alter in Jahren [Median/
Spannweite]
Immun- suppression [Anzahl]
Antibiotische Vortherapie [Anzahl]
Hämato- onkologisch
29/70 (41,4%)
W:12 M:17
8/
0-25
26/29 (89,7%)
20/30 (66,7%) Z.n.
Knochenmarks- transplantation
6/70 (8,6%)
W:3 M:3
9/
3-14
6/6 (100%)
5/6 (83%)
Z.n. Organ- transplantation
6/70 (8,6%)
W:5 M:1
6,5/
1-14
6/6 (100%)
3/6 (50%) Chronische
Lungenerkrankung
10/70 (14,3%)
W:7 M:3
9/
0-14
1/10 (10%)
6/10 (60,0%) Neuromuskuläre
Erkrankung
3/70 (4,3%)
W:1 M:2
4/
0-22
1/3 (33,3%)
0/3 (0%)
Sonstige 5/70
(7,1%)
W:5 M:0
5/
1-16
1/5 (20%)
1/5 (20%) Ohne chronische
Erkrankung
11/70 (15,7%)
W:3 M:8
2,5/
0-14
0/11 (0%)
1/11 (9%) Insgesamt 70/70
(100%)
W:36 M:34
6,5/
0-25
41/70 (58,6%)
36/70 (51,4%)
3.2. Erregernachweis in der Standardkultur und dem SeptiFast
Bei den 70 Proben aus der BAL konnten in der gesamten Kohorte bei 59/70 (84,3%) der Patienten ein positives Ergebnis nachgewiesen werden. Hierbei ergab der SF ohne Berücksichtigung möglicher Kontaminationen in 58/70 Proben (82,9%) einen positiven Nachweis, wovon 37/70 Proben allein über den SF – bei negativer Kultur – positiv für einen potenziell pathogenen Erreger waren. Die Kultur ergab in 22/70 Proben (31,4%) einen positiven Nachweis für Bakterien oder Pilze (p< 0,001) (s. Tab. 5).
Tabelle 5: Häufigkeit der positiven Ergebnisse in der Gesamtkohorte im SF und der Kultur mit eingeschlossener Kontamination
SF+ SF- Summe
Kultur + 21 1 22
Kultur - 37 11 48
Summe 58 12 70
In 28 Fällen (40,0%) wurde mindestens ein Erreger im SF nachgewiesen, den wir zuvor als Kontamination zu wertendem Erreger definiert hatten. In 5 Proben (7,1%) zeigte sich in der Kultur eine Kontamination. Zudem wurde in 16 Fällen (22,9%) im SF oder der Kultur ein als Kontamination zu wertendem Erreger zusätzlich zu einem potenziell pathogenen Erreger detektiert. In diesen Fällen wurden die Proben als insgesamt positiv gewertet.
Führender Erreger war hierbei insgesamt die Streptokokken- spp.-Gruppe mit 19 Nachweisen, gefolgt von einer Candida-spp. mit 9 und den koagulase-negativen Staphylokokken sowie einer Enterokokken-spp. mit jeweils 6 Nachweisen.
Nach Ausschluss der als Kontamination zu wertenden Erregern gelang der positive Erregernachweis in der Gesamtkohorte bei 53/70 Patienten (75,7%). In der Gruppe der Kultur waren 18/70 Proben (25,7%) positiv und 52/70 BAL-Proben (74,3%) negativ. Beim SF waren 47/70 (67,1%) BAL-Proben positiv und 23/70 (32,9%) negativ.
In 17/70 (24,3%) BAL-Proben konnte mittels beider Methoden kein Erreger nachgewiesen werden. Bei 35 der 52 negativen Kulturen (67,3%) wurde im SF ein Erreger gefunden. Bei negativen SF gelang in 6/23 Fällen (26,1%) der Erregernachweis in der Kultur (s. Tab. 6).
Tabelle 6: Häufigkeit der positiven Ergebnisse in der Gesamtkohorte im SF und der Kultur unter Ausschluss der Kontamination
SF+ SF- Summe
Kultur + 12 6 18
Kultur - 35 17 52
Summe 47 23 70
Die Ergebnisse sind entsprechend dem McNemar-Testergebnis von p < 0,001 als statistisch signifikant einzustufen. Die Ergebnisse in der Kreuztabelle (Tab. 6) ergaben einen Kappa-Koeffizienten von ᴋ = 0,004 und die Übereinstimmung beider Testverfahren sind folgend als „schwach“ einzustufen.
Für den Nachweis mittels dem SF zeigt sich eine Sensitivität von 0,67 und eine Spezifität von 0,33. Dem gegenübergestellt hat die Kultur eine Sensitivität von 0,26 und eine Spezifität von 0,74. Es ergibt sich ein positiver prädiktiver Wert (PPV) von 0,26 und ein negativer prädiktiver Wert (NPV) 0,74 für den SF. Bei der Kultur haben wir einen PPV von 0,67 und einen NPV von 0,32.
Betrachtet man die Nachweise für Bakterien und Pilze isoliert, so zeigt sich im alleinigen Nachweis für Bakterien in der Kultur in 17/70 (24,3%) und im SF in 43/70 (61,5%) der Proben ein positives Ergebnis. In 32/53 negativen Kulturen (75,7%) konnte der SF zusätzlich eine Bakterien-Spezies nachweisen (s. Tab. 7).
Tabelle 7: Häufigkeit der positiven Ergebnisse für Bakterien im SF und der Kultur unter Ausschluss der Kontamination
SF+ SF- Summe
Kultur + 11 6 17
Kultur - 32 21 53
Summe 43 27 70
Beim alleinigen Pilznachweis zeigt sich ein positiver Nachweis in 2/70 (2,9%) Proben in der Kultur und in 7/70 (10,0%) Proben im SF. In einem Fall hatte die Standardkultur lediglich ein isoliertes positives Ergebnis. Der hier ermittelte Erreger Paecilomyces variotii zählt dabei nicht zum Spektrum des SF und kann mittels SF nicht nachgewiesen werden (s. Tab. 8).
Tabelle 8: Häufigkeit der positiven Ergebnisse für Pilze im SF und der Kultur unter Ausschluss der Kontamination
SF+ SF- Summe
Kultur + 1 1 2
Kultur - 6 62 68
Summe 7 63 70
Entsprechend dem McNemar-Test von p < 0,001 für die Ergebnisse der Bakterien sind diese als statistisch signifikant und einem p=0,125 für die Pilze als statistisch nicht-signifikant einzustufen.
Mit einem Kappa-Koeffizienten von ᴋ=0,028 für Bakterien und ᴋ=0,186 für Pilze folgt jeweils eine „schwache“ Übereinstimmung beider Testverfahren.
3.3. Spektrum der positiven Ergebnisse
In 14/70 Proben (20,0%) wurden in der Kultur und in 39/70 Proben (55,7%) im SF mindestens ein potenziell pathogener Erreger gefunden. In 4/70 Proben (5,7%) wurden in der Kultur und in 6/70 Proben (8,6%) im SF zwei verschiedene potenziell pathogener Erreger gefunden. Im SF konnte zudem in 2/70 Proben (2,9%) ≥3 potenziell pathogene Erreger nachgewiesen werden (s. Abb. 2).
14
4 0
52 39
6 2
23
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
1 2 ≥3 Kein
Nachweis Anzahl der nachgewiesenen Erreger
in Prozent (%)
Kultur SF
Abbildung 2: Anzahl nachgewiesenen Erreger innerhalb einer Probe in der Kultur und im SeptiFast (SF)
Insgesamt wurden 68 potenziell pathogene Erreger in den 70 Proben gefunden (s.
Tab. 9). Hiervon waren 44/68 (64,7%) grampositive Bakterien, 16/68 (23,5%) gramnegative Bakterien und 8/68 (11,8%) Pilze.
Tabelle 9: Das Spektrum der nachgewiesenen Erreger aufgeteilt nach dem alleinigen Nachweis in der Standardkultur (Kultur +) oder dem SeptiFast (SF +), dem Nachweis in beiden Verfahren (B +) und dem gesamten Nachweis (Summe +)
*= nicht im Spektrum des SF enthalten
Bakterien Kultur + SF + B + Summe +
Gram-Positiv
Streptococcus pneumoniae 27 1 28
Staphylococcus aureus 2 11 3 16
Gesamtanzahl (Gram-positiv) 2 38 4 44
Gram-Negativ
Haemophilus influenzae* 4 4
Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) 2 2
Moraxella catarrhalis* 1 1
Enterobacter (cloacae/aerogenes) 2 1 3
Stenotrophomonas maltophilia 1 1 2
Achromobacter xylosoxidans* 1 1
Escherichia coli 2 1 3
Gesamtanzahl (Gram-negativ) 8 3 5 16
Gesamtanzahl (Bakterien) 10 41 9 60
Pilze Kultur + SF + B + Summe +
Aspergillus fumigatus 6 1 7
Paecilomyces variotii* 1 1
Gesamtanzahl (Pilze) 1 6 1 8
Gesamtanzahl 11 47 10 68
Mit dem SF konnten 47/68 (69,1%) der nachgewiesenen Erreger ermittelt werden.
Hiervon zählten 38/47 (80,9%) zu den grampositiven Bakterien, 3/47 (6,3%) zu den gramnegativen Bakterien und 6/47 (12,8%) zu den Pilzen.
Der alleinige Nachweis mittels Kultur erzielte 11/68 (16,2%) der potenziell pathogenen Erreger. Hierbei waren 2/11 (18,2%) grampositive Bakterien, 8/11 (72,7%) gramnegative Bakterien und 1/11 (9,1%) Pilze.
Im simultanen Nachweis beider Methoden wurden 10/68 (14,7%) der potenziell pathogenen Erreger nachgewiesen. Hier waren 4/10 grampositive Bakterien (40,0%), 5/10 (50,0%) gramnegative Bakterien und 1/10 (10,0%) Pilze.
Unter Einbeziehung der simultan positiven Nachweise, wurde in der Kultur am häufigsten der Staphylococcus aureus (n=5) und der Haemophilus influenzae (n=4) nachgewiesen (s. Abb. 3). Die häufigsten Erreger im SF waren der Streptococcus pneumoniae (n=28) sowie der Staphylococcus aureus (n=14) (s.
Abb. 4).
n=21
1
4 5
2 1 1 1 1
3
1 1
01 23 45 67 89 10
Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae
Staphylococcus aureus Klebsiella pneum
oniae
Moraxella catarrhalis
Enterobacter cloacae complex Stenotrophom
onas maltophilia
Achromobacter xylosoxidans Escherichia coli
Aspergillus fumigatus Paecilom
yces variotii
Abbildung 3: Spektrum der positiv ermittelten Erreger (Bakterien und Pilze) in der Kultur, (n = 21)
n=57
28
14
2 3 2 1
7 0
5 10 15 20 25 30
Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus Klebsiella pneum
oniae
Enterobacter cloacae com plex
Stenotrophom
onas maltophilia
Escherichia coli
Aspergillus fumigatus
Abbildung 4: Spektrum der positiven Erreger (Bakterien und Pilze) im SeptiFast (n=57)
Im Vergleich der häufigsten nachgewiesenen Erreger war der Nachweis von Streptococcus pneumoniae in der Kultur in einer Probe mit simultanem Nachweis des Erregers im SF möglich. 27 der 28 Nachweise für Streptococcus pneumoniae erfolgten allein durch den SF. Haemophilus influenzae als Erreger war in keiner Probe innerhalb des SF nachweisbar. Hierbei gilt zu beachten, dass Haemophilus influenzae sowie Achromobacter xylosoxidans, Paecilomyces variotii und Moraxella catarrhalis nicht im Spektrum des SF erfasst werden (s. Tab. 9).
3.4. Patienten unter Immunsuppression
Innerhalb der Studie stammen 41/70 BAL-Proben (58,6%) aus der Kohorte der immunsupprimierten Patienten. Zunächst zeigten sich in der Kultur 11/41 Proben (26,8%) und im SF 31/41 (75,6%) positiv (s. Tab. 10).
Tabelle 10: Häufigkeit der positiven Ergebnisse im SF und der Kultur bei immunsupprimierten Patienten mit eingeschlossener Kontamination
SF+ SF- Summe
Kultur + 11 0 11
Kultur - 20 10 30
Summe 31 10 41
Nach Ausschluss einer Kontamination wurden aus den 41 Proben in der Kultur insgesamt 7/41 (17,1%) und im SF 22/41 (53,7%) Proben als positiv gewertet.
Innerhalb der 34/41 (82,9%) negativen Kultur-Proben konnte mittels SF ein zusätzlicher positiver Nachweis in 19/34 (55,9%) Proben erzielt werden (s. Tab.
11).
Tabelle 11: Häufigkeit der positiven Ergebnisse im SF und der Kultur bei immunsupprimierten Patienten unter Ausschluss der Kontamination
SF+ SF- Summe
Kultur + 3 4 7
Kultur - 19 15 34
Summe 22 19 41
Mit einem McNemar-Testergebnis von p=0,003 werden die Ergebnisse als statistisch signifikant angesehen. Die Werte ergeben einen Kappa-Koeffizienten von ᴋ=-0,07. Dies ergibt eine „schwache“ Übereinstimmung beider Methoden.
Betrachtet man den Nachweis für Bakterien und Pilze im Einzelnen, so ergibt sich bei den Bakterien ein positiver Nachweis in der Kultur in 6/41 (14,6%) und im SF in 19/41 (46,3%) Proben. Kein Nachweis für Bakterien konnte in 35/41 Kultur- Proben (85,4%) gelingen, wovon wiederum mittels SF in 16/35 (45,7%) Fällen ein positives Ergebnis erzielt werden konnte (s. Tab. 12).
Tabelle 12: Häufigkeit der positiven Ergebnisse für Bakterien im SF und der Kultur bei immunsupprimierten Patienten unter Ausschluss der Kontamination
SF+ SF- Summe
Kultur + 3 3 6
Kultur - 16 19 35
Summe 19 22 41
Bei den Pilzen war die Kultur in 1/41 (2,4%) und der SF in 6/41 (14,6%) Proben positiv. Bei dem kulturell nachgewiesenen Erreger handelt es sich um Paecilomyces variotiii, welcher nicht Teil des Erregerspektrums des SF
ist. Daraus resultiert ein Erregernachweis für Aspergillus fumigatus im SF von 14,6% (6/41) und fehlendem Nachweis in der Kultur (s. Tab. 13).
Tabelle 13: Häufigkeit der positiven Ergebnisse für Pilze im SF und der Kultur bei immunsupprimierten Patienten unter Ausschluss der Kontamination
SF+ SF- Summe
Kultur + 0 1 1
Kultur - 6 34 40
Summe 6 35 41
Im McNemar-Test zeigt sich ein statistisch signifikantes Ergebnis für Bakterien (p=0,004) und ein statistisch nicht-signifikantes Ergebnis für Pilze (p=0,125). Beide Methoden weisen mit einem Kappa-Koeffizienten von ᴋ=0,023 für Bakterien und ᴋ=-0,044 für Pilze eine „schwache“ Übereinstimmung auf.
3.5. Erregerspektrum innerhalb der Patienten unter Immunsuppression
In der Analyse der immunsupprimierten Patienten konnten insgesamt 35 verschiedene potenziell pathogene Erreger nachgewiesen werden. Hierbei zählten 20/35 (57,1%) zu den grampositiven Bakterien, 8/35 (22,9%) zu den gramnegativen Bakterien und 7/35 (20,0%) zu den Pilzen (s. Tab. 14).
Tabelle 14: Das Spektrum der nachgewiesenen Erreger beim immunsupprimierten Patientenkollektiv aufgeteilt nach dem alleinigen Nachweis in der Standardkultur (Kultur +) oder dem SeptiFast (SF +), dem Nachweis in beiden Verfahren (B +) und dem gesamten Nachweis (Summe +)
*= nicht im Spektrum des SF enthalten
Bakterien Kultur + SF + B + Summe +
Gram-Positiv
Streptococcus pneumoniae 14 1 15
Staphylococcus aureus 1 4 5
Gesamtanzahl (Gram-positiv) 1 18 1 20
Gram-Negativ
Haemophilus influenzae* 1 1
Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) 1 1
Moraxella catarrhalis* 1 1
Enterobacter (cloacae/aerogenes) 1 1 2
Stenotrophomonas maltophilia 1 1 2
Achromobacter xylosoxidans* 0
Escherichia coli 1 1
Gesamtanzahl (Gram-negativ) 3 2 3 8
Gesamtanzahl (Bakterien) 4 20 4 28
Pilze Kultur + SF + B + Summe +
Aspergillus fumigatus 6 6
Paecilomyces variotii* 1 1
Gesamtanzahl (Pilze) 1 6 0 7
Gesamtanzahl 5 26 4 35
Die potenziell pathogenen Erreger wurden in 26/35 Fällen (74,3%) nur mittels SF und in 5/35 Fällen (14,3%) mittels Kultur nachgewiesen. Ein Nachweis mittels beider Methoden erfolgte in 4/35 Fällen (11,4%). Die Verteilung zeigte im SF 18/26 (69,2%) grampositive Bakterien, 2/26 (7,7%) gramnegative Bakterien und 6/26 (23,1%) Pilze.
Bei der Kultur waren es 1/5 (20,0%) grampositiven Bakterien, 3/5 (60,0%) gramnegative Bakterien und 1/5 (20,0%) Pilze.
Mittels beider Methoden waren es 1/4 (25,0%) grampositive Bakterien, 3/4 (75,0%) gramnegative Bakterien und keine Pilze (0/4).
Insgesamt wurde in allen Proben der immunsupprimierten Kohorte am häufigsten der Streptococcus pneumoniae (n=15), gefolgt vom Aspergillus fumigatus (n=6) und Staphylococcus aureus (n=5) nachgewiesen. Streptococcus pneumoniae wurde dabei in 14/15 Fällen allein durch den SF nachgewiesen.
Bei den 5 Erregern, die nur mittels Kultur nachgewiesen wurden, zählen 3 zu denjenigen, die im Spektrum des SF nicht miterfasst werden (Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis und Paecilomyces variotii).
3.6. Bakteriennachweis nach antibiotischer Vortherapie
34/70 Proben (48,6%) zählten zur Kohorte der antibiotisch vortherapierten Patienten. Zunächst wurden insgesamt 4/34 (11,8%) positive Proben mittels der Kultur und 22/34 Proben (64,7%) mit dem SF nachgewiesen (s. Tab. 15).
Tabelle 15: Häufigkeit der positiven Ergebnisse für Bakterien im SF und der Kultur nach antibiotischer Vortherapie mit eingeschlossener Kontamination
SF+ SF- Summe
Kultur+ 2 2 4
Kultur- 20 10 30
Summe 22 12 34
Nach Ausschluss der Kontamination wurden 2/34 (5,9%) positive potenziell pathogene Erreger in der Kultur und 16/34 (47,1%) im SF erfasst. Die jeweiligen positiven Ergebnisse waren mit der jeweils anderen Methode nicht nachzuweisen.
In 16/34 Proben (47,1%) konnte mittels beider Methoden kein Nachweis gelingen (s. Tab. 16).
Tabelle 16: Häufigkeit der positiven Ergebnisse für Bakterien im SF und der Kultur nach antibiotischer Vortherapie unter Ausschluss der Kontamination
SF+ SF- Summe
Kultur+ 0 2 2
Kultur - 16 16 32
Summe 16 18 34
Mit einem McNemar-Test von p=0,001 werden die Ergebnisse für den Bakteriennachweis beim antibiotisch vortherapierte Patientenkollektiv als statistisch signifikant angesehen. Eine schwache Übereinstimmung beider Testergebnisse resultiert aus einem Kappa-Koeffizient von ᴋ=-0,117.
3.7. Bakteriennachweis nach antibiotischer Vortherapie bei immunsupprimierten Patienten
Bei den Patienten mit antibiotischer Vortherapie wurden 27/34 (79,4%) Patienten als immunsupprimiert eingeordnet. Hier war die Kultur in 1/27 Proben (3,7%) und der SF in 11/27 Proben (40,7%) positiv. Bei den 26/27 (96,3%) negativen kulturellen Proben konnte im SF in 11/26 (42,3%) Proben ein positives Ergebnis erzielt werden. Bei 15/27 (55,6%) BAL-Proben konnte mittels beider Verfahren kein potenziell pathogener Erreger ermittelt werden (s. Tab. 17).
Tabelle 17: Häufigkeit der positiven Ergebnisse für Bakterien im SF und der Kultur nach antibiotischer Vortherapie unter Immunsuppression unter Ausschluss der Kontamination
SF+ SF- Summe
Kultur+ 0 1 1
Kultur- 11 15 26
Summe 11 16 27
Das Ergebnis ist statistisch als signifikant (McNemar-Test von p=0,004) einzuordnen. Eine „schwache“ Übereinstimmung beider Testergebnisse ergibt sich aus einem Kappa-Koeffizient von ᴋ=0,067.
3.8. Pilznachweis unter antimykotischer Vortherapie
14/70 Proben (20,0%) stammen aus dem Patientenkollektiv der antimykotisch vortherapierten. Der positive Pilznachweis ohne Berücksichtigung einer Kontamination erfolgte in der Kultur in 2/14 Proben (14,3%) und im SF in 5/14 Proben (35,7%) (s. Tab. 18).
