2.1. Patientenauswahl
Im Rahmen der vorliegenden Studie wurden im Zeitraum von September 2011 bis Mai 2017 bei insgesamt 70 Patienten bestehend aus Kindern und Jugendlichen (34 männlich, 36 weiblich) im Alter von 0 - 25 Jahren mit pulmonalen Infektionen die BAL durchgeführt. Die aspirierte Spülflüssigkeit wurde daraufhin mittels der Standardkultur und dem SF auf mögliche pathogene Keime untersucht. Die BAL erfolgte im Rahmen eines stationären Aufenthaltes am Zentrum für Kinder – und Jugendmedizin über die pneumologische Abteilung der Klinik für Kinderheilkunde III (Leitung Prof. Dr. med. D. Reinhardt) des Universitätsklinikums Essen. Die Patienten wurden während des Aufenthaltes nicht beatmet und waren somit spontanatmend.
Die 70 entnommenen Proben, entsprechend der Patienten, wurden in der vorliegenden Arbeit auf ihren Wert und Relevanz im Hinblick auf die mikrobiologische Diagnostik in der Pädiatrie untersucht.
Die retrospektive Datenanalyse der ausgewählten Patienten wurde durch das lokale Ethikkommitee des Universitätsklinikums Essen nach entsprechender Prüfung genehmigt (15-6499-BO).
2.2. Material
Die Bronchoskopie sowie die BAL wurden nach einem standardisierten flexibel-endoskopischen Verfahren durchgeführt. Dieses erlaubt dem Untersucher einen Einblick auf den zu untersuchenden Bereich der Lunge. Die Lingula und der Mittellappen stellen bei nicht lokalisierten Infektionen aufgrund der kleinsten Fläche innerhalb der Lungenlappen und der damit verbunden höchstmöglichen Aspirationsmenge der Spülflüssigkeit den bevorzugten Untersuchungsort dar. Bei lokalisierten Infektionen wird der zuvor radiologisch oder bronchoskopisch ermittelte veränderte Lungenlappen gewählt. Die BAL wird unter kardiorespiratorischem Monitoring durchgeführt (Midulla & Nenna, 2010).
In der Studie wurde die Bronchoskopie sowie die BAL nach standardisiertem Verfahren entsprechend der Empfehlung der „American Thoracic Society“
ausgeführt (Faro et al., 2015). Nach Einleitung der Sedierung erfolgte der transnasale Zugang mit einem flexiblen Bronchoskop. Nach erster Inspektion der oberen Atemwege, erfolgte eine Lokalanästhesie der Schleimhäute des Larynx mit 0,5ml 1%-igen Lidocain-Spray mittels „spray-as-you-go“-Technik (Kaur et al., 2015). Hiernach erfolgte die Inspektion des Bronchialsystems. Die BAL wurde an der Stelle durchgeführt, an der sich die radiologisch-vermutete Pathologie befand und bei nicht eingrenzbarer Veränderung wurde standartisiert der rechte mittlere Lungenlappen gewählt. Das flexible Endoskop wurde in den ausgewählten Bronchus vorgeschoben. Über den Arbeitskanal wurde 1ml/kg Körpergewicht sterile Kochsalzlösung in den gewählten Bronchus eingebracht. Im Anschluss erfolgte die manuelle Aspiration der eingebrachten Flüssigkeit. Der Vorgang wurde bis zu vier mal wiederholt. Die Proben der BAL wurden einzeln aserviert.
Das gewonnene Material wurde unmittelbar ins mikrobiologische Labor des Instituts für Medizinische Mikrobiologie des Universitätsklinikums Essen (Leitung Prof. Dr. med. J. Buer) transportiert, wo die Testung mittels dem kulturellen und dem PCR-Verfahren erfolgte.
Für den mikrobiellen Nachweis der Mikroorganismen mittels der Kultur wurden feste Nährmedien entsprechend der Qualitätsstandards in der mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik (MiQ) verwendet. Hierbei wurden auch gesonderte Nährböden für die Kultivierung von gramnegativen Bakterien und Hefen (Candida Spezies (spp.)) verwendet. Es wurden allgemein erhältliche Agar-Platten genutzt (Columbia Blood Agar, Columbia Agar with Sheep Blood, Cooked Blood Agar, MacConkey Agar, Brilliance selektive Agar, Malt extract Agar, Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Deutschland).
Bei einer Temperatur von 37 °C wurden die Nährböden bis zu 72 Stunden lang inkubiert. Malzextrakt-Agarplatten wurden zudem bei Raumtemperatur für mindestens 7 Tage inkubiert. Nach jeweils 24 und 48 Stunden Inkubationszeit wurden die Nährböden evaluiert. Dabei wurden im semi-quantitativen Verfahren die Anzahl der herangewachsenen Kolonien ermittelt. Die Identifikation und Resistenztestung der Bakterien erfolgte mittels standardisierten mikrobiologischen Verfahrens unterstützt von der VITEK® MS Massenspektromie und der VITEK® 2 mit der VITEK® 2 AST Karte (Vitek MS; Vitek 2, bioMerieux, Marcy l’Etoile, Frankreich).
Für den mikrogenetischen Nachweis der pathogenen DNA wurde der LightCycler®
SeptiFast (SF) verwendet. Dabei handelt es sich um ein „real-time Multiplex-PCR“- Verfahren, das eine quantitative Analyse der DNA aus 20 verschiedenen Bakterien, Hefe- und Schimmelpilzen ermöglicht.
Der Nachweis beim SF erfolgt in drei Schritten. Zunächst wird die Probe in Form einer mechanischen Lyse vorbereitet. Dabei wird mit Hilfe von Proteasen und Puffern die DNA freigesetzt. Die DNA wird hierdurch von sonstigen Bestandteilen (z.B. Proteinen) getrennt und es wird eine interne Kontrolle zur Probe hinzugefügt.
Im nächsten Schritt wird die DNA unter Verwendung von Primern in drei parallelen Reaktionen für grampositive und gramnegative Bakterien sowie für Pilze vervielfältigt. Die Bestimmung des Genotyps erfolgt durch Schmelzkurvenanalyse mittels einer automatisch durchgeführten Software (SeptiFast Identification Software). Zu den möglichen Genotypen zählen bei den grampositiven Bakterien Staphylococcus aureus, Koagulase-negative Staphylococci, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus spp. (Streptococcus agalacticae, Streptococcus
pyogenes, Streptococcus mitis), Enterococcus faecium und Enterococcus faecalis.
Die gramnegativen Genotypen sind Escherichia coli, Klebsiella (pneumoniae/oxytoca), Serratia marcescens, Enterobacter (cloacae/aerogenes), Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii und Stenotrophomonas maltophilia. Zu den nachweisbaren Pilzen zählen Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida glabrata und Aspergillus fumigatus (LightCycler® SeptiFast, Roche, Mannheim, Deutschland).
2.3. Datenerfassung
Die Patientendaten wurden aus der digitalen Patientenakte entnommen, wo auch die mikrobiologischen Ergebnisse der jeweiligen BAL aus der Kultur und dem SF erfasst worden waren. Das Geburtsdatum, das Geschlecht und die Grunderkrankung der Patienten wurden aus den digitalisierten Arztbriefen im SAP sowie der archivierten Akten entnommen.
Anhand der Grunderkrankung bzw. der Medikamenteneinnahme wurden die Patienten in eine Gruppe immunkompetenter und immunsupprimierter Patienten eingeteilt. Als immunsupprimiert galten diejenigen Patienten, die eine hämato-onkologische Grunderkrankung hatten und unter Chemo-und/oder Strahlentherapie standen, mit Zustand nach (Z.n.) Knochenmark- oder einer soliden Organtransplantation waren, eine immunsuppressive Therapie erhielten oder einen angeborenen Immundefekt hatten.
Eine mögliche vorherige antibiotische oder antimykotische Therapie war den Patientenakten zu entnehmen.
Die Pateinten galten als antibiotisch oder antimykotisch vortherapiert, wenn eine Therapie innerhalb der letzten 24 Stunden vor Durchführung der BAL und entsprechender Probeentnahme stattgefunden hat. Entsprechend dieser Daten erfolgte die Eingruppierung in Patienten mit oder ohne antibiotische/antimykotische Therapie. Bei 3 von 70 Patienten konnte die Datenlage hinsichtlich einer Vortherapie nicht mehr retrospektiv rekonstruiert werden.
2.4. Kontamination
Bei den diagnostizierten Erregern galt zu bedenken, dass der SF für die Diagnostik von pathogenen Erregern innerhalb von BK und nicht primär für die BAL entwickelt wurde (LightCycler® SeptiFast, Roche, Mannheim, Deutschland) und somit ein anderes Keimspektum abdeckt. Daher wurde eine mögliche Kontamination nach Auswertung der positiv ermittelten Erreger berücksichtigt. So wurden diejenigen Bakterien und Pilze in die Auswertung nicht miteinbezogen und als Kontamination gewertet, die der oropharyngealen Standartflora angehören und diejenigen die nicht zum pathogenen Keimspektrum sowohl bei der CAP als auch bei der HAP zuzurechen sind. Zu diesen zählen unter anderem die vergrünenden (viridans) Streptokokken, Neisserien, Corynebakterien, Staphylococcus epidermidis, Entercoccus faecalis et faecium und weitere koagulase-negative Staphylokokken sowie die Candida spp. (Ewig et al., 2016, Dalhoff et al., 2017).
Das Erregerspektrum ist der Tab. 2 zu entnehmen. Die genannten Erreger wurden dementsprechend auch nicht bei den Ergebnissen der Kultur gewertet.
Tabelle 2: Häufige und seltene Erreger ambulant erworbener Pneumonien bei Diagnostik aus dem Sputum. *Haemophilus parainfluenzae kann in seltenen Fällen Erreger der ambulant erworbenen Pneumonie sein (S3-Leitlinie Behandlung von erwachsenen Patienten mit ambulant erworbener Pneumonie und Prävention – Update 2016)
Häufige und mögliche Erreger Seltene Erreger Keine Erreger - Streptococcus pneumoniae
2.5. Statistische Analyse
Alle Daten wurden mit dem Tabellenkalkulationsprogramm Excel von Windows®
erfasst. Nach Verschlüsselung erfolgte die Datenanalyse. Dazu wurde die Statistik-Software der IBM® SPSS® Statistics in der Version 24.0. verwendet.
Zur Erfassung der Häufigkeiten wurden deskriptive Verfahren verwendet. Für die Darstellung der Patientencharakteristika, zu denen das Alter und Geschlecht zählen, wurde der Mittelwert, das Minimum und Maximum sowie der Median bestimmt. Ebenso wurden für die positiven als auch negativen Ergebnisse in der Kultur und dem SF, die Diagnosen und antibiotische wie auch antimykotische Vortherapie die deskriptive Datenanalyse in Form der Häufigkeit gewählt.
Für die Auswertung der dichotomen Variablen wurde eine Kreuztabelle ermittelt.
Innerhalb dieser wurde der McNemar-Test für die Zusammenhänge der entsprechenden Dichotomien durchgeführt. Die Ergebnisse wurden als statistisch signifikant angenommen, wenn eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 vorlag.
Für den Grad der Übereinstimmung der Ergebnisse der beiden Testverfahren (Kultur und SF) wurde der Kappa-Koeffizient nach Cohen (ᴋ) in der jeweiligen Kreuztabelle ermittelt. Die Interpretation der Werte für ᴋ erfolgte entsprechend der Richtwerte in Tab. 3 (Grouven et al. 2007).
Tabelle 3: Richtwerte zur Interpretation von ᴋ (nach Altman)
Wert von ᴋ Stärke der Übereinstimmung
< 0,20 schwach
0,21 – 0,40 leicht
0,41 – 0,60 mittelmäßig
0,61 – 0,80 gut
0,81 – 1,00 sehr gut