2 Methoden
2.2 Patientenkohorte
Es wurden 304 Patienten mit MDS oder sAML, welche mit allogener Stammzelltransplantation therapiert wurden, in die Kohorte eingeschlossen. Die Transplantation wurde in vier deutschen Zentren (Dresden, Düsseldorf, Hamburg und Hannover) im Zeitraum von 1996 und 2011 durchgeführt.
Von diesen Patienten wurde vor der Transplantation eine Probe entnommen. Die mononukleären Zellen wurde mithilfe der Ficoll-Dichtezentrifugation isoliert und bei -196°C in flüssigem Stickstoff gelagert oder die DNA und RNA wurden direkt extrahiert.
Die klinischen und hämatologischen Daten der Patienten wurden mit ihrem Einverständnis in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki aufgezeichnet. Die wissenschaftliche Analyse erfolgte nach Zustimmung der Ethikkomission der Medizinischen Hochschule Hannover (Nr.5558/2011).
DNA von 14 gesunden Blutspendern wurde als Kontrolle für die NGS-Sequenzierung verwendet.
2.3 Methoden
2.3.1 Zytogenetische Untersuchung
Die Bestimmung des Karyotyps erfolgte mittels konventioneller zytogenetischer Analyse im Institut für Humangenetik der Medizinischen Hochschule Hannover. Der Karyotyp wurde mittels G- und R-Bänderungsanalyse sowie falls nötig, ergänzend mit Fluoreszenz in-situ Hybridisierung, bestimmt. Es wurden sowohl numerische als auch strukturelle Aberrationen wie Insertionen, Deletionen, Translokationen und Inversionen festgestellt. Diese wurden nach einer international gängigen Nomenklatur für Humanzytogenetische Befunde beschrieben (Simons, Shaffer, &
Hastings, 2013).
2.3.2 Grundkonzept
2.3.3 Gewinnung der Proben
Extraktion der mononukleären Zellen aus KM oder PB mit Bicoll Dichtezentrifugation Zur Isolation der mononukleären Zellen Knochenmark oder peripheren Blut wurde eine Dichtezentrifugation mit Bicoll durchgeführt.
Dazu wurde das vorhandene Material zunächst im Verhältnis 1:1 mit Phosphate Buffered Saline (PBS) in einem 50ml Falcon gemischt. In ein zweites 50ml Falcon wurde Bicoll gegeben. Die Menge entsprach 1/3 des Gesamtvolumens aus dem ersten Falcon. Danach wurde das Material-PBS Gemisch vorsichtig auf das Bicoll geschichtet. Dabei wurde darauf geachtet, dass sich die beiden
Extraktion Von genomischer DNA
aus ED Proben
ggf. Amplifikation
Bestimmung der Mutationen mit dem Myeloid
Panel
Mutationsanlayse
Validierung der Mutationen mit Sanger Sequenzing
Flüssigkeiten nicht mischen. Dann wurde es bei 840g für 20 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nun lag eine Dreischichtung im Falcon vor. Am Boden des Falcon sammelte sich Zellschrott und Erythrozyten. Darüber lag eine Schicht Bicoll, über der sich eine Schicht mit mononukleären Zellen befand. Zuoberst lagen alle restlichen Bestandteile. Die Schicht mit den mononukleären Zellen wurde vorsichtig abpipettiert und in ein neues Falcon übertragen. Dieses wurde nun bis zur 50ml Marke mit PBS aufgefüllt und bei 135 g für 10 Minuten zentrifugiert um die Zellen zu waschen. Der Überstand wurde dekantiert. Um mögliche Verunreinigungen zu minimieren, wurden im nächsten Schritt vorhandene Erythrozyten lysiert. Dafür wurde zunächst BD Pharm Lyse TM mit destilliertem Wasser im Verhältnis 1:10 gemischt. Von der entstandenen Lösung wurden 1000 µl auf das Pellet gegeben und vermischt. Nach einer Inkubation von 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Falcon erneut bis 50ml Marke mit PBS aufgefüllt und für 10 Minuten bei 135 g zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet erneut in 1000 µl PBS gelöst.
Zur Zählung wurde eine Neubauer Zählkammer verwendet. Das Volumen mit der gewünschten Zellzahl wurde entnommen und in ein neues Teströhrchen überführt. Die DNA wurde dann mit dem Allprep DNA/RNA Purification Kit (Quiagen, Hilden Deutschland) extrahiert.
DNA Extraktion mit AllPrep
Aus den extrahierten Zellen wurde mithilfe des Allprep DNA/RNA Purification Kit (Quiagen, Hilden Deutschland) DNA extrahiert. Diese wurde entweder direkt weiterverarbeitet oder bei -20°C gelagert.
Dafür wurden zunächst die in PBS gelösten Zellen für 5 Minuten für 300 g zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Dabei wurden maximal 1x107 Zellen verwendet. Nach erneuter Zentrifugation konnte dann der restliche PBS Überstand mit der Pipette vorsichtig entnommen werden, sodass möglichst nur noch Zellen im Teströhrchen waren. Durch Zugabe von 600µl des Lysepuffers RLT plus wurden die Zellen lysiert. Der Puffer besteht aus Guanidiniumthiocyonat einem chaotropes Salz. Dieses sorgt durch Störung von Wasserstoffbrückenbindungen für ein Aufbrechen der Zellmembranen und Denaturieren von Proteinen. Außerdem sind Bestandteile enthalten welche die Bindung der DNA an die Trennsäule ermöglichen. Durch mehrmaliges vorsichtiges Auf- und Abpipettieren wurde das Lysat sorgfältig homogenisiert. Zur weiteren und besseren Homogenisierung wird das Lysat dann auf eine QIAshreddersäule gegeben und 2 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Das homogenisierte Lysat sammelt sich in dem 2ml Sammelgefäß. Danach wird es auf eine AllPrep DNA Trennsäule (im Kit enthalten) gegeben. Diese wurde dann bei geschlossenem Deckel für 30s bei 8000g zentrifugiert. Die DNA ist nun an die positiv geladene Membran der Trennsäule gebunden. Aus dem Durchfluss kann RNA extrahiert werden.
Um die DNA zu extrahieren wurde die AllPrep DNA Trennsäule in ein neues 2ml Sammelröhrchen gestellt. Zum Waschen der DNA wurde 500µl AW1 Puffer auf die Trennsäule gegeben. Dieser Puffer hat ebenfalls einen hohen Anteil chaotroper Salze und führt so zu einer Denaturierung der Proteine und reinigt die DNA weiter auf. Diese wurde dann bei 8000g für 15 s zentrifugiert. Der Durchfluss im Sammelröhrchen wurde verworfen. Zur weiteren Aufreinigung wurde 500µl AW2 Puffer auf die Trennsäule gegeben und diese dann, bei geschlossenem Deckel, für 2 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Die Hauptkomponente des AW2 Puffers ist Ethanol.
Dieser bindet die chaotropen Salze. Die Dauer der Zentrifugation ist wichtig, um die Membran komplett vom Ethanol der Puffer zu trocknen. Nun wurde die Trennsäule mit der getrockneten Membran aus dem Sammelröhrchen entfernt und in ein 1,5 ml Teströhrchen gestellt. Durch Zugabe von 100µl H2O auf die Membran wurde die DNA aus der Bindung mit den chaotropen Salzen gelöst. Dadurch wird die Bindung an die positiv geladene Membran geringer und die DNA
aus der Membran gelöst. Nach 1 Minute Inkubation wird alles für 1 Minute bei 8000g zentrifugiert. Zur Maximierung der Menge und Verhinderung einer Verdünnung der DNA-Konzentration wird der Durchfluss erneut auf die Säule gegeben und der Schritt wiederholt Da die RNA für die weiteren Experimente nicht benötigt wird, soll die Extraktion hier nicht genauer beschrieben werden.
Amplifikation
Für die Durchführung des TruSight Myeloid Sequencing Panel (Illumina, San Diego, USA) wird eine dsDNA Konzentration von mindestens 5ng/µl benötigt. Falls die dsDNA Konzentration oder die Menge zu gering war, wurde sie mit dem RepliG Kit (Quiagen, Hilden, Deutschland) amplifiziert. In mehreren Publikationen konnte bereits gezeigt werden, dass bei ausreichendem dsDNA Einsatz in das Kit die Ergebnisse bei NGS vergleichbar mit genomischer DNA sind (Hou et al., 2012).
Außerdem verfügt das verwendete Enzym, die Phi29 Polymerase, über eine 3‘5‘ Exonuklease Proof Reading Funktion und vermeidet so Fehler, welche später die Auswertung des Myeloid Sequencing Panel stören könnten.
Zur Durchführung nach Herstellerangaben wurden 10ng genomische DNA in 5µl Wasser benötigt.
Falls die Konzentration geringer war als 2ng/µl wurden 5µl genomische DNA eingesetzt. Zunächst wurden 5µl des Denaturierungspuffers zu der genomische DNA hinzugegeben und gut vermischt.
Die alkalische Denaturierung der genomischen DNA bietet den Vorteil, dass der Anteil der DNA, die fragmentiert oder abasisch ist, sehr gering bleibt. Nach 3 min Inkubationszeit bei Raumtemperatur wurde die Denaturierungsreaktion mit 10µl Neutralisationspuffer gestoppt.
Danach wurden 30µl Mastermix bestehend aus Puffer und Phi29 Polymerase hinzugeben. Der komplette Ansatz wurde danach für 16 h bei 30°C im T100 Thermocycler (BioRad, Hercules, USA) inkubiert. Zum Beenden der Reaktion, wurde die Probe für 3 Min auf 70°C im Thermocycler erhitzt. Nach Messung der DNA-Konzentration wird die amplifizierte DNA, wenn nötig mit Wasser verdünnt.
Messung der DNA-Konzentration
Die Konzentration der DNA wurde mit dem QubitTM-fluoremetic Quantitation 2.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) bestimmt. Die Messung wurde nach Herstellerangaben durchgeführt.
Dafür wurde zunächst ein Mastermix aus 199µl Puffer und 1µl Farbstoff pro Probe erstellt. Von diesem Mastermix wurden 199µl zu 1µl Probe pipettiert und für 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach konnte die DNA-Menge mit dem Fluorometer gemessen werden.
Alle folgenden Messungen, wenn nicht anders beschrieben, wurden mit dieser Methode durchgeführt.
2.3.4 Illumina TruSight Myeloid Sequencing Panel Konzept
Mithilfe des Panels ist es möglich 54 unterschiedliche Gene bei bis zu 192 Proben gleichzeitig zu untersuchen, wenn die Proben auf dem Illumina Hiseq2500 sequenziert werden. Damit ist es möglich, ein schnelles und effizientes Screening von vielen Patientenproben auf verschiedene Mutationen durchzuführen.
Zuerst wurden verschiedene Oligonukleotide an die genomische oder amplifizierte DNA 5' oder 3' der Zielregion hybridisiert. Nach 80 Minuten Inkubationszeit wurden die ungebundenen Oligonukleotide durch mehrere Waschschritte entfernt. Dann wurden die gebundenen
Oligonukleotide verbunden. Dazu wird eine PCR mit einem Zyklus durchgeführt. Eine Polymerase verlängert die DNA von einem Primer über die gewünschte Region hinweg bis zum unteren Primer. Dadurch entsteht ein Produkt, welche die gewünschte Region sowie Sequenzen enthält, welche für die Amplifikation entscheidend sind. Im nächsten Schritt wurden während einer PCR an ebendiese Sequenzen Primer mit entsprechen patientenspezifischen Barcodes ergänzt. Die Primer enthalten außerdem noch die Adapter für die Flowcell im Illumina Hiseqgerät. Danach werden die Proben zur Kontrolle auf ein Gel aufgetragen und mit Ampure Beads XP (Beckman Coulter, Brea, USA) aufgereinigt, bevor sie für die Sequenzierung gepoolt werden.3
Falls keine weiteren Erklärungen oder Hinweise auf die Chemikalien gegeben werden, sind diese alle im TruSight Myeloid Sequencing Panel (Illumina, San Diego, USA) enthalten.
Vorbereitung
Die Konzentration der DNA-Proben wurde gemessen und auf eine Konzentration von 50ng DNA in 10µl destilliertem Wasser angepasst. Die Messung erfolgt dabei mit einer Fluoreszenz basierten Methode. Hier wurde die Quibit Messung (Thermo Fisher Scientific) wie oben beschrieben verwendet.
Hybridisierung
Zu jeder Probe wurden 5µl TruSightOligos und 35 µl Oligo Hybridization for Sequencing 2-Puffer gegeben. Dann wurde die Platte mit Aluminiumklebefolie verschlossen und 1 min auf den Hybex Microsample Incubator (Sci Gene, USA) mit 95°C gestellt. Nach dieser Zeit wurde der Hybex Microsample Incubator auf 40°C eingestellt und die Proben in der Abkühlungszeit, die ca. 80min dauert weiterinkubiert. Die hohe Temperatur zu Beginn denaturiert die DNA d.h. die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden Doppelsträngen werden aufgespalten, sodass nun zwei Einzelstränge vorliegen. Bei dem langsamen Abkühlen können sich nun die Oligonukleotide/Primer an die Zielregionen binden.
Waschen, Extension und Ligation
Nach der Inkubationszeit, wurde die Platte aus dem Hybex Microsample Incubator genommen und der komplette Ansatz auf eine neu zusammengesetzte, einmal vorgewaschene Filterplatte übertragen und für 5 min bei 2400xg bei Raumtemperatur zentrifugiert. Für den ersten Waschschritt wurde zu jeder Probe 45µl Stringent Wash 1-Puffer (SW1) gegeben und die Platte erneut zentrifugiert. Der komplette Schritt wurde dann mit SW1 und Universal Buffer 1(UB1) jeweils einmal wiederholt. Der SW1-Puffer bindet an die DNA, vor allem an die ungebundene Oligonukleotide aus der vorangegangenen Hybridisierung. Durch eine Größenselektion in der Platte werden die ungebundenen Oligonukleotide durchgelassen, während die genomische DNA in dem Filter bleibt. Der UB1 -Puffer entfernt die Rückstände des SW1 Puffers.
Danach wurde zu jeder Probe 45µl Extension-Ligation Mix 4 (ELM4) gegeben und die Platte für 45 min bei 37°C im Sanyo MIR-153 Refrigerated Incubator inkubiert. Dieser Mix enthält sowohl eine Polymerase als auch eine Ligase. Die Polymerase verlängert vom 3‘-Oligonukleoitd/Primer die DNA in Richtung 5’Ende. Danach verbindet die Ligase das neue DNA-Stück mit dem 5’Oligonukleotid.
Am Ende dieses Schrittes liegen die gewünschten DNA-Bereiche in kleiner Menge in der Lösung vor. Durch die PCR im nächsten Schritt wurden die Zielregionen amplifiziert.
3 Siehe Illumina Protokoll für Myeloid Panel
https://support.illumina.com/content/dam/illumina- support/documents/documentation/chemistry_documentation/trusight/trusight-myeloid-sequencing-panel-protocol-guide-1000000005004-01.pdf
Stand 04.12.2018
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Zur Vorbereitung wurde in jede Vertiefung einer neuen 96-Wells Platte eine spezifische Kombination aus 2 Barcodeprimern pipettiert. Es wurden jeweils 4µl verwendet (Schema der Primer siehe Tabelle 14). Die Zahlen in der obersten Zeile geben den Barcode für die jeweilige Spalte an. Die Zahlen in der linken Spalte den Barcode für die jeweilige Zeile. Dadurch entsteht für jede Zelle ein einzigartiger Barcode, sodass nach dem Poolen jede Patientenprobe einem Ergebnis zugeordnet werden kann.
Tabelle 14 Schema Barcode Primer für Myeloid Panel
Barcode 701 702 703 704 705 706 707 708 709 710 711 712
Nach der Inkubationszeit wurde in jedes Well der Filterplatte 27µl frisch hergestellte 50mM Natronlauge (NaOH) gegeben, um die DNA aus dem Filter zu lösen. Nach 5 min Inkubationszeit bei Raumtemperatur wurden 20µl der NaOH mit den gelösten Proben in die mit Primern vorbereitete 96-Wells Platte übertragen. Zum Schluss wurden noch 22µl eines Mastermixes bestehend aus PMM2 (PCR Mastermix 2) und TDP 1 (TruSeq DNA Polymerase 1) hinzugeben. Dann wurde die Platte mit einer Folie verschlossen und durchlief im Thermocycler T100 (BioRad, USA) folgendes Programm:
Initiale Denaturierung 95°C 3 min
Denaturierung 95°C 30 sec
27 Zyklen
Hybridisierung 66°C 60 sec
Elongation 72°C 30 sec
Finale Elongation 72°C 5 min
Hold 10°C ∞
Gelbild
Die Gelelektrophorese wird zur Kontrolle des PCR Ergebnis durchführt. Dabei werden die PCR-Produkte aufgrund ihrer elektrischen Ladung und ihres Molekulargewichtes aufgetrennt. Da DNA positiv geladen ist laufen die Fragmente zum negativen Pol. Große Fragmente bewegen sich dabei langsamer als kurze Fragmente und sind deshalb im Gelbild weiter oben zu finden. Durch den Vergleich mit der DNA Leiter ist es möglich die Größe der sichtbaren DNA Fragmente abzuschätzen.
Zunächst wurde ein 2%iges Gel aus Agarose und TAE Puffer 1x hergestellt. Dieses wurde aufgekocht bis sich die Agarose vollständig gelöst hat. Nach dem Abkühlen wurde für je 100ml TAE Puffer 3µl Ethidium Bromid zugegeben. Dann wurde das Gel auf einen Schlitten gegossen.
Nach dem Abkühlen wurde für jede Probe ein Gemisch aus 5µl Probe und 1µl Farbstoff auf das Gel aufgetragen. Die Auswertung erfolgte mithilfe von Anregung durch UV-Licht, wodurch die Gelbanden fluoreszieren. Die Dokumentation der Ergebnisse erfolgte mithilfe des ChemiDoc Imaging Systems (BioRad, USA).
Aufreinigung
Für die Aufreinigung wurden Ampure Beads XP Agentcourt (Beckman Coulter, USA) verwendet.
Diese SPRI (Solid Phase Reversible Immobilization) basierte Bead Methode reinigt sowohl einsträngige als auch doppelsträngige DNA auf mit einer Größenspannbreite von 150bp – 10kb.
Dabei sollen besonders effizient Primer, Primerdimer, dNTPs und Salze aus der PCR Reaktion entfernt werden. Das entstehende Produkt ist sowohl für weitere PCR Reaktionen als auch für NGS und Sanger geeignet.4
In einer 96-Wells Platte wurde je 45µl Probe vorgelegt. Zu jeder Probe wurden 45µl Beads gegeben und diese für 2 Min bei 1800rpm auf dem Mikroplattenschüttler BioShake XP (Qinstruments, Jena, Deutschland) gemischt und dann für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Danach wurde die Platte auf ein Magnetrack gestellt. Die magnetischen AmpureBeads waren nun an den Seiten der Platte und der klare Überstand konnte abgenommen werden. Danach wurden die Beads zweimal mit 80% Ethanol gewaschen und für 5 min getrocknet bevor sie in 30 µl Elution Buffer with Tris gelöst wurden. Nach erneutem Schütteln wurden sie wieder auf das Magnetrack gestellt und der klare Überstand wurde in eine Platte überführt. Hier war nun die DNA enthalten.
Library Preparation
Zunächst wurde die Konzentration aller Proben mit einer Fluoreszenz basierten Methode bestimmt. Abhängig davon wurden sie alle auf die gleiche Konzentration verdünnt. In jede Verdünnung wurde unabhängig von der Konzentration der Probe 5µl der Probe eingesetzt. 5µl jeder Verdünnung der 96 Proben wurde dann in ein neues 1,5ml Teströhrchen pipettiert. Der fertige Pool wurde dann zum Helmholtz Zentrum in Braunschweig verschickt. Dort wurden die Proben auf dem Hiseq Gerät sequenziert.
2.3.5 Vorbereitung eines Runs auf dem Illumina Hiseq2500
Die Sequenzierung wurde auf einem Illumina Hiseq 2500 (San Diego, Kalifornien) mit einem Hiseq Rapid SBS Kit v2 für 250 Zyklen durchgeführt.
4 Infos aus Präsentation Why AmpureBeads von folgneder Internetseite
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERE R&_urlType=render&wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-
and-services%252Fnucleic-acid-sample-preparation%252Fagencourt-ampure-xp-pcr- purification%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/A63880///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch- and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fnucleic-acid-sample-preparation%2Fagencourt-ampure-xp-pcr-purification%2Findex.htm/ Stand 07.01.2016
2.3.6 Mutationsanalyse
Die Mutationsanalyse wurde mit dem Ensembl-Transkript ENST00000269305.8 durchgeführt.
2.3.7 Validierung
Die gefundenen Mutationen wurden ab einer Variantallelfrequenz (VAF) von 5% gewertet, wenn es Hotspotmutationen waren. Alle anderen Mutationen wurden ab einer VAF von 10% gewertet.
Mutationen mit VAF unter 10% wurden nicht gewertet. Zur Bestätigung dieser Mutationen wurden sie jeweils mit Sanger Sequenzierung validiert.