Optimierung der LFA – Komponenten

Zur Optimierung der LFA – Komponenten werden die Methoden von Choi et al. (2010), Zhang et al. (2009) und Kolosova et al. (2008) als Grundlage genutzt. In den Vorversuchen wird Wi 11 – 1G3G11 [3,85 mg/ml] als primärer Antikörper für die Testlinie und Goat – Anti Mouse IgG [2 mg/ml] als Antikörper für die Kontrolllinie unverdünnt eingesetzt. Es wird die Hi Flow Plus 240 Membran verwendet. Die Testlinie und Kontrolllinie werden manuell mittels Pipette auf-getragen, wobei das Volumen 2,5 μl/cm (je 2 x aufgetragen) beträgt. Die Membran wird anschließend für 5 Minuten bei RT vorgetrocknet und dann für 1h bei 30°C in den Trockenofen

gegeben. Nach dem Trocknen wird die Membran für 30 Minuten in 1% PVP (in 100 mM PBS) eingelegt und danach mit destilliertem Wasser für 1 Minute unter dem Wasserhahn gewaschen.

Im Anschluss daran erfolgt die Inkubation der Membran in 5% Succrose (in 10 mM PB) für 15 Minuten sowie erneutes Waschen mit destilliertem Wasser für 1 Minute unter dem Wasserhahn.

Zum Abschluss wird die Membran in Plastikschalen gelegt, die am Boden gewellt sind, sodass die Trocknung auch auf der unteren Membranseite gewährleistet werden kann. Die Plastik-schalen werden mit perforierter Alufolie abgedeckt und die Trocknung der Membran erfolgt über Nacht bei RT. Das Konjugatpad wird aus der Vorlage in Streifen (0,6 cm x 10 cm) geschnitten.

Das hergestellte Goldkonjugat (500 μl) wird mit 500 μl einer 5% Succrose – 1% BSA – 0,5%

Tween 20 Lösung (in 40 mM PBS) direkt im Eppendorfgefäß auf dem Vortexer gemischt.

Anschließend wird der Konjugatpadstreifen sorgfältig gefaltet und mittels Pipette ins Goldkonjugat getaucht, sodass dieser sich vollsaugen kann. Der mit Konjugat durchtränkte Streifen wird zum Trocknen auf Pipettenspitzen in eine Plastikschale gelegt, sodass die Auflagefläche des Streifens möglichst gering ist und das Goldkonjugat im Pad bleibt. Dadurch können Wechselwirkungen mit der Plastikoberfläche auf ein Minimum reduziert werden. Die Plastikschale wird ebenfalls mit perforierter Alufolie abgedeckt und das Konjugatpad bei RT über Nacht getrocknet. Das Sample Pad und das Absorbentpad werden nach den, unter Punkt 2.4 beschriebenen Maßen zurecht geschnitten und nicht vorbehandelt. Der Zusammenbau und der LFA – Test werden ebenfalls nach Punkt 2.4 durchgeführt, wobei die in den Vorversuchen eingesetzten Probenvolumina 150 μl betragen. Die Fischproben der 3 getesteten Fischarten werden für die Vorversuche mit PB 10 mM (pH 7,0) 10fach verdünnt.

Während der Untersuchungen zeigt sich, dass die Kombination der im Vorfeld beschriebenen Parameter, Komponenten sowie Reagenzien die besten Ergebnisse hinsichtlich der Bildung von Test und Kontrolllinie liefern. In Abbildung 16 sind die Testreifen abgebildet, die entsprechend der Vorgehensweise behandelt sind.

Abbildung 16: Optimierte Teststreifen der Vorversuche

Anhand von Abbildung 16 ist zu sehen, dass die Testlinie und Kontrolllinie klar zu erkennen sind. Dabei hat sich die Kontrolllinie nach 3 Minuten und die Testlinie nach 5 Minuten gebildet, wobei der Testreifen nach 3 Minuten durchgelaufen ist, d. h. das Absorbentpad erreicht. Der Testdurchlauf ist sehr schnell und es bildet sich eine einheitliche Flowfront. Die Intensität der Linien, insbesondere der Testlinie, nimmt nach 15 Minuten nicht mehr zu. Das Fischallergen Parvalbumin kann bei den in Abbildung 16 angegebenen Proteinkonzentrationen klar detektiert werden. Des Weiteren zeigt sich, dass die gegen Kabeljau gerichteten monoklonalen Antikörper eine Kreuzreaktivität gegenüber Hering und Alaska Seelachs aufweisen.

Zur Optimierung der LFA – Komponenten bzw. zur Entwicklung der im Vorfeld beschriebenen Vorgehensweise werden während der Vorversuche verschiedene Experimente durchgeführt.

Dabei werden zunächst unterschiedliche Vorbehandlungen der LFA – Komponenten getestet, um den Einfluss auf die Singnalentwicklung und das Laufverhalten zu überprüfen. Die jeweiligen Testkombinationen sind in Tabelle 5 dargestellt.

Tabelle 5: Kombination verschiedener Vorbehandlungen der LFA Komponenten Vers

.

Sample Pad Konjugatpad Membran Membrantyp

1 unbehandelt 0,5% BSA +

0,2% Tween 20

1% BSA + 5%

Succrose Hi Flow Plus 75 2 unbehandelt 0,5% Casein +

0,5% Tween 20

1% BSA + 5%

Succrose Hi Flow Plus 75 3 0,5% Tween 20 + 5%

Succrose +5% Dextran + 0,05% Natriumazid

unbehandelt 1% BSA + 5%

Succrose Hi Flow Plus 75 4

unbehandelt

5% Succrose + 1% BSA + 0,5%

Tween 20

2% Casein Hi Flow Plus 75

5

unbehandelt

5% Succrose + 1% BSA + 0,5%

Tween 20

1% PVP + 5%

Succrose Hi Flow Plus 75 6

unbehandelt

5% Succrose + 1% BSA + 0,5%

Tween 20

1% PVP + 5%

Succrose Hi Flow Plus 240

Bei den in Tabelle 5 dargestellten Kombinationen wird lediglich die Fischprobe des Kabeljaus eingesetzt, um eine Test – und Kontrolllinie zu erzeugen. Zudem wird zu Beginn Wi 11 – 3G9D5 [2,5 mg/ml] als primärer Antikörper auf der Membran immobilisiert und Wi 11 – 1G3G11 [3,85 mg/ml] als sekundärer Antikörper zur Herstellung des Goldkonjugats genutzt. Bei den Versuchen 1 – 3 kann mit den Vorbehandlungen und der Antikörperpaarkombination weder eine Test – noch eine Kontrolllinie erzeugt werden. Zudem ist festzustellen, dass aus dem unbehandelten Konjugatpad (V3) kein Goldkonjugat eluiert, obwohl das Sample Pad entsprechend vorbehandelt wird. Das liegt vermutlich daran, dass das Goldkonjugat nach der Trocknung nicht mehr resolubilisiert werden kann und in Wechselwirkungen mit glasfaserartigem Material des Konjugatpads tritt. Das Phänomen ist in den Versuchen 1 – 2 nicht erkennbar, da der Einsatz von BSA und des grenzflächenaktiven Stoffes Tween 20 diesem Verhalten entgegenwirken. Eine Wiederholung des Versuchs sowie der Tausch zwischen dem primären und sekundären Antikörper bringen keinen Erfolg. Die Teststreifen der Versuche 1 – 3 sind in Abbildung 17 dargestellt.

Abbildung 17: Teststreifen Versuche 1 – 3

Mit den Versuchen 4 – 5 wird die Versuchsplanung überdacht und angepasst, da in den Versuchen 1 – 3 kein zufriedenstellendes Ergebnis erzielt wird. Dabei erfolgt die Kombination neuer Vorbehandlungen nach Kolosova et al. (2008). Der Tausch der Antikörperpaarungen, d. h.

die Verwendung von Wi 11 – 1G3G11 [3,85 mg/ml] als primärer und Wi 11 – 3G9D5 [2,5 mg/ml] als sekundärer Antikörper wird beibehalten. Durch die Anpassungen kann ein Signal erzeugt werden, jedoch sind beide Linien verwischt und deshalb nicht voneinander zu differenzieren. Als Ursache für die unklaren Linien werden die Eigenschaften der Membran Hi Flow Plus 75 sowie der geringe Abstand zwischen den Linien (0,5 cm) ermittelt. Es wird festgestellt, dass der Membrantyp für die Untersuchungen ungeeignet ist, da die Lauffläche sehr dünnschichtig ist und somit bei der manuellen Antikörperimmobilisierung leicht beschädigt werden kann. Des Weiteren wird beobachtet, dass sich beim Auftragen der Antikörper ein breiter Hof bildet, d. h. der flüssige Antikörper geht zu sehr in die Breite, wodurch sich die Linie ebenfalls verbreitert. Diesem Verhalten kann durch den Einsatz von weniger Antikörpervolumen nicht entgegengewirkt werden, weshalb die robustere Membran Hi Flow Plus 240 mit einer dickschichtigen Lauffläche für den Versuch 6 ausgewählt wird. Außerdem zeigt sich, dass das Laufverhalten der Flowfront durch 1% PVP Lösung im Gegensatz zu 1% BSA verbessert werden kann. Die 2 % Casein Lösung ruft ebenfalls gute Laufeigenschaften hervor, jedoch ist die Kombination der Vorbehandlung von Membran und Konjugatpad optimaler. Insbesondere die Vorgehensweise nach Kolosova et al. (2008) zur Behandlung des Goldkonjugats mit der 5%

Succrose - 1% BSA - 0,5% Tween 20 Lösung bewirkt eine signifikante Verbesserung der

Farbintensität und der Signalentwicklung. Die Testreifen aus den Versuchen 4 – 5 mit den verwischten Linien sind in Abbildung 18 dargestellt.

Abbildung 18: Testreifen Versuche 4 – 5

Die im Versuch 6 beschriebene Vorbehandlung bringt die besten Ergebnisse hinsichtlich Laufverhalten, Signalentwicklung und Signalstärke und stellt deshalb die optimalen Bedin-gungen dar. Während der Vorversuche werden neben den bereits erwähnten Membrantypen (HF 75, HF 240) die Eigenschaften der Membrantypen HF 090, HF 135 und HF 180 untersucht. Es zeigt sich, dass lediglich die Membran HF 180 für weitere Testzwecke in Frage kommt, da sie ebenfalls eine robustere Lauffläche im Vergleich zu den anderen Membrantypen aufweist. Des Weiteren ermöglicht sie auch eine verbesserte Reaktionszeit für die Komplexbildung zwischen sAK – Antigen – pAK durch die geringere Laufgeschwindigkeit. Letztendlich stellt jedoch die Membran HF 240 das Optimum dar. Auf Grund ihrer hohen Schichtdicke und der geringeren Laufgeschwindigkeit besitzt sie einerseits die besten Grundvoraussetzungen für die manuelle Antikörperimmobilisierung und andererseits gewährleistet sie ausreichend Reaktionszeit für die Komplexbildung bzw. für die Signalentwicklung.

Das Ziel der Vorversuche einen LFA – Teststreifen zu entwickeln, der eine Testlinie und eine Kontrolllinie anzeigt, wird erreicht. Zudem erfolgt die Optimierung der Vorbereitungsschritte zur Herstellung der LFA – Komponenten. Auf Grundlage der in den Vorversuchen ermittelten Ergebnisse erfolgen die Untersuchungen bzw. Experimente der Hauptversuche.