Studiengang Lebensmittel – und Bioprodukttechnologie WS 2013/14
Die Entwicklung eines Lateral Flow Assay zum Nachweis
von Fischallergenen
Verfasser: Robert Falk
1. Betreuer: Prof. Dr. rer. nat. Christine Wittmann 2. Betreuer: Prof. Dr. sc. agr. Heidrun Schniedewind
Abstract
The work is about the development of a Lateral Flow Assay for the detection of fish allergen, especially Parvalbumin, in food. In general food allergy increases over the last years and becomes a problem of public interest, because of the health hazard for persons concerned. Parvalbumin is identified to be the main fish allergen that is responsible for about 90 % of IgE – mediated immune reactions to fish. The aim of the work is to develop a colloidal gold-based Lateral Flow Assay for the rapid detection of Parvalbumin in food. Therefore several investigations are performed to optimize the production of colloidal goldparticles and the preparation of the LFA components developing a high sensitive LFA. Finally a test for the detection of Parvalbumin of codfish with an LOD of 4,88 μg/ml is developed. Furthermore a cross reactivity of the used monoclonal antibody (specific for codfish) against pollack (up to 48 μg/ml) and hering (up to 49 μg/ml) could be determined. Further investigations, especially in complex food, to optimize the developed LFA are necessary.
INHALTSVERZEICHNIS
VERZEICHNIS DER VERWENDETEN FORMELZEICHEN, SYMBOLE UND
ABKÜRZUNGEN ... 4
1. EINLEITUNG ... 5
1.1 Lebensmittelallergie ... 7
1.1.1 Definition & Klassifikation ... 7
1.1.2 Aufbau & Funktionalität des Immunsystems ... 9
1.1.3 Antikörper ... 15
1.1.4 Immunologische Mechanismen allergischer Reaktionen ... 17
1.1.5 Allergene & Fischallergen Parvalbumin ... 20
1.1.6 Rechtliche Rahmenbedingungen zur Kennzeichnungspflicht von Allergenen ... 22
1.2 Immunchromatographische Anaylseverfahren ... 24
1.2.1 Allgemein... 24
1.2.2 Lateral Flow Assay ... 26
2. MATERIAL & METHODEN ... 27
2.1 Chemikalien & Equipment ... 27
2.1.1 Chemikalien ... 27
2.1.2 Puffer & Lösungen ... 28
2.1.3 Antikörper ... 29
2.1.4 Fischproben ... 29
2.1.5 LFA – Komponenten ... 29
2.1.6 Geräte ... 30
2.2 Lateral Flow Assay ... 30
2.2.1 Aufbau ... 31
2.2.2 Funktionsprinzip ... 34
2.3 Versuchsvorbereitung ... 37
2.3.1 Fischprobenaufbereitung ... 37
2.3.2 Proteingehaltbestimmung ... 37
2.3.3 Untersuchung zur optimalen Konjugation zw. Antikörper und kolloidalem Gold ... 38
2.3.4 Herstellung des Antikörper – Nanogold – Konjugats ... 39
2.3.5 Vorbereitung der LFA – Komponenten ... 39
2.4 LFA – Testdurchführung ... 41
3. ERGEBNISSE ... 43
3.2 Konjugationsoptimierung zwischen Nanogoldpartikeln und sekundärem Antikörper ... 44
3.3 Vorversuche ... 46
3.3.1 Herstellungsoptimierung vom Antikörper – Nanogold – Konjugat ... 47
3.3.2 Optimierung der LFA – Komponenten ... 49
3.4 Hauptversuche ... 55
3.4.1 Ermittlung optimaler Antikörperpaarkombination ... 55
3.4.2 Ermittlung der LFA – Nachweisgrenze ... 61
3.4.3 Signalstärkenoptimierung & Verbesserung der Nachweisgrenze... 66
4. ABSCHLUSSDISKUSSION ... 71
5. ZUSAMMENFASSUNG ... 75
LITERATURVERZEICHNIS ... 76
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ... 80
TABELLENVERZEICHNIS ... 81
Verzeichnis der verwendeten Formelzeichen, Symbole und Abkürzungen
AS - Aminosäure
BfR - Bundesinstitut für Risikobewertung
CD - Cluster of Differentiation
CDR - Complementarity Determining Regions
DNA - Desoxyribonukleinsäure
ECARF - European Centre for Allergy Research Foundation
ELISA - Enzyme – linked Immunosorbent Assay
IgA - Immunglobulin A IgD - Immunglobulin D IgE - Immunglobulin E IgG - Immunglobulin G IgM - Immunglobulin M IL - Interleukin
kDA - Kilo Dalton (atomare Masse)
KP I - Konjugatpadpuffer I
LFA - Lateral Flow Assay
LMKV - Lebensmittelkennzeichnungsverordnung
LOAEL - Lowest Observed Adverse Effect Level
MB I - Membranpuffer I
MHC - Major Histocompatibility Complex
MRI - Max Rubner – Institut
nm - Nanometer
OD - Optische Dichte
PCR - Polymerase Chain Reaction
pAK - primärer Antikörper
RT - Raumtemperatur
sAK - sekundärer Antikörper
pg - Pikogramm
SPR – Biosensoren - Surface Plasmon Resonance Biosensoren
1. Einleitung
In der öffentlichen Gesundheit der Bevölkerung sind in der heutigen Zeit allergieauslösende Lebensmittel ein Problem von stetig wachsender Bedeutung, da einerseits eine Zunahme von Lebensmittelallergien über die letzten Jahrzehnte zu verzeichnen ist und andererseits mit ihnen ein hohes gesundheitliches Risiko für die Betroffenen einhergeht [1]. Als Ursachen für den stetigen Anstieg von Lebensmittelallergien vermutet man die sich ändernden Lebens – und Ernährungsgewohnheiten der Bevölkerung, hervorgerufen durch die Globalisierung und das erweiterte Nahrungsmittelangebot [2]. Schätzungen zufolge leiden etwa 4 – 8% der deutschen Bevölkerung unter Nahrungsmittelallergien oder Nahrungsmittelunverträglichkeiten. [3] [2]. Das Bewusstsein, einer ständig präsenten Gefahr bei der Nahrungsaufnahme ausgesetzt zu sein sowie die mühsame Nahrungsmittelbeschaffung, bedingt durch das aufmerksame Studieren der Zutatenliste auf der Lebensmittelverpackung, vermindern die Lebensqualität der Allergiker erheblich [4]. Zur Verbesserung des Verbraucherschutzes hat die Europäische Kommission die EU Richtlinien 2003/89, 2006/142 und 2007/68/EG als Ergänzung zur EU Richtlinie 2000/13 zur Kennzeichnung bzw. Deklaration von Inhaltsstoffen erlassen [5]. Darin enthalten sind unter anderem die kennzeichnungspflichtigen allergischen Inhaltsstoffe, wobei letztendlich 8 Allergene für mehr als 90% der auftretenden Lebensmittelallergien verantwortlich sind [5]. Zu dieser Kategorie gehören neben Eiern, Milch, Gluten, Krustentiere, Nüsse (Erdnüsse, Baumnüsse) und Sojabohnen auch Fisch als einer der Hauptverursacher von allergischen Symptomen, wie z. B. Atemwegsstörungen, Kreislaufbeschwerden, Hautreizungen, Verdauungs-störungen oder einem lebensbedrohlichen anaphylaktischem Schock [6].
In einer gesunden Humanernährung nimmt Fisch eine wichtige Rolle ein, da er reichhaltig an mehrfachungesättigten Fettsäuren (Eicosapentaensäure, Docosahexaensäure), fettlöslichen Vitaminen sowie an Proteinen mit einer hohen biologischen Wertigkeit ist [7]. Eine Fischallergie stellt demnach neben den gesundheitlichen Risiken auch einen signifikanten Einschnitt für die Ernährungsweise dar. Hauptsächlich ist die Fischallergie bei Kindern und jungen Erwachsenen zu beobachten bzw. bei Personen aus Küstenregionen / Küstenländern wie z. B. Norwegen, die einen hohen Fischkonsum aufweisen oder in der Fischindustrie tätig sind [7] [8]. Für über 90% der Betroffenen ist das Fischallergen Parvalbumin der Hauptverursacher einer IgE – vermittelten Immunreaktion des Körpers [9] [10]. Bei Parvalbumin handelt es sich um Ca2+/Mg2+ bindende Muskelproteine, die vorwiegend im weißen Muskelfleisch von Fischen, wie z. B. Kabeljau, Seelachs oder Flunder, vorkommen und die Bewegungsabläufe (Muskelentspannung) unterstützen [10].
Zum Nachweis von Parvalbumin in Lebensmittelprodukten existieren bereits mehrere Verfahren, wie z. B. PCR, ELISA oder SPR – Biosensoren [11]. Der gemeinsame Vorteil dieser Methoden ist die hohe Spezifität und Sensitivität, sodass bereits Spuren von Parvalbumin in der Nahrung detektiert werden können. Die Nachweisgrenze beim ELISA liegt z. B. bei 0.01 mg Parvalbumin/kg Lebensmittel [12]. Mittels PCR ist der Nachweis von Parvalbumin sogar bis auf die Nukleinsäurenebene möglich, jedoch wird das Allergen nicht direkt nachgewiesen, weshalb die Methode vorwiegend als Indikator für allergene Lebensmittelbestandteile eingesetzt wird [13]. Die aufgeführten Nachweisverfahren sind jedoch sehr zeitaufwendig, arbeitsintensiv, kostenintensiv und teilweise laborgebunden, zumal deren Durchführung geschultes und qualifiziertes Personal erfordert [5]. Deshalb ist die Entwicklung eines praktikablen Schnelltests, der zuverlässig, genau und zeitsparend arbeitet sowie die Rechtsvorschriften erfüllt, unumgänglich [5]. Einerseits kann dadurch der Hersteller die Problematik der „versteckten Allergene“, d h. die Kontamination (Kreuzkontaminationen) von Lebensmittelprodukten mit Parvalbumin, während des Herstellungsprozesses schnell und kostengünstig überprüfen, wodurch der Verbraucherschutz steigt. Andererseits sind Schnelltests auch für den Verbraucher geeignet, um Lebensmittel, die mit Spuren von Fisch deklariert sind, zu überprüfen, wodurch sich Produktauswahl und Produktsicherheit erhöhen und letztendlich zur Verbesserung der Lebensqualität für den Allergiker führen. Grundlage für die Entwicklung des Schnelltestformats zum Parvalbuminnachweis bildet dabei die Methode Lateral Fow Assay, welche auf immunchromatographischen Vorgängen basiert, bei denen spezifische Antigen – Antikörper Wechselwirkungen genutzt werden, um entsprechende Analyten, wie z. B. Hormone, Toxine, Pestizide oder Allergene, optisch nachzuweisen [14]. Vorteile dieser Technik sind die kurzen Analysezeit, das benutzerfreundliche Format, die lange Haltbarkeit (Lagerfähigkeit) sowie die kostengünstige Herstellung, weshalb sich die Technik in vielen Bereichen etabliert hat, wie z. B. in der Medizin zum Nachweis von Krankheiten, pathogenen Organismen, Schwangerschaften oder in der Strafverfolgung zum Drogennachweis [15] [16].
Die Masterarbeit beschäftigt sich demnach mit der Entstehung von Lebensmittelallergien und den dabei ablaufenden immunologischen Mechanismen im menschlichen Körper, wobei insbesondere auf die Fischallergie, die rechtlichen Rahmenbedingungen zur Kennzeichnungs-pflicht und deren Einfluss auf die Lebensmittelindustrie eingegangen wird. Das Hauptziel der Arbeit ist die Entwicklung eines LFA basierenden Schnelltests zum qualitativen Nachweis von Fischallergenen, einschließlich dessen Beurteilung hinsichtlich Funktionalität, Sensitivität und Praktikabilität im Vergleich mit anderen etablierten Nachweisverfahren.
1.1 Lebensmittelallergie
1.1.1 Definition & Klassifikation
Im Allgemeinen handelt es sich bei Lebensmittelallergien um abnormale immunologische Reaktionen gegenüber Lebensmitteln, die bestimmte Inhaltsstoffe (Allergene) enthalten [4]. Dabei differenziert man Lebensmittelallergien anhand der Vermittlungsart und der Zeitdifferenz von Allergenaufnahme / Nahrungsmittelaufnahme bis hin zur ersten Überempfindlichkeits-reaktion in 2 Kategorien [4]. Im Vergleich dazu handelt es sich bei Lebensmittelintoleranzen um Unverträglichkeitsreaktionen auf Lebensmittel oder deren Inhaltsstoffe unter Ausschluss des Immunsystems und der damit verbundenen Bildung von Antikörpern [9]. Abbildung 1 gibt dabei einen schematischen Überblick zur Einteilung von Nahrungsmittelallergien und Nahrungsmittel-unverträglichkeiten.
Abbildung 1: Einteilung von Nahrungsmittelallergien und Nahrungsmittelintoleranzen
Reaktionen auf
Lebensmittel
Lebensmittelallergie Lebensmittelintoleranz
Zell – vermittelte – Allergie (nicht IgE vermittelt)
z. B. - Zöliakie Typ – I – Allergie (IgE vermittelt) z. B. - Erdnussallergie - Fischallergie - Kuhmilchallergie Enzymatische Int. (Stoffwechselstörung) z. B. - Laktoseintoleranz Pharmakologische Int. z. B. - Biogene Amine - Glutamate 1 2 1 2 Idiosynkratische Int. z. B. - Sulfit bedingtes Asthma - Tartrazin bedingtes Asthma 3
Zur 1. Kategorie der Lebensmittelallergien zählt die Typ – I – Allergie (Soforttyp), welche durch Immunglobin E (IgE) Antikörper vermittelt wird und allergische Reaktionen innerhalb von Minuten bis maximal 1 Stunde nach der Nahrungsaufnahme auftreten [4]. Die IgE Antikörper bewirken die Ausschüttung von Histamin und weiteren Botenstoffen durch die Mastzellen, wodurch allergische Symptome, wie z. B. Asthma, Nasenschleimhautentzündungen, Schwel-lungen und Erweiterung der Blutgefäße, hervorgerufen werden [17]. Zudem kann durch IgE vermittelte Reaktion eine Anaphylaxie ausgelöst werden, bei der es sich um eine schnell und heftig auftretende Immunreaktion handelt, die durch Abfall des Blutdrucks, Brustschmerzen und Kreislaufschock gekennzeichnet ist [17]. Eine Anaphylaxie ist demnach sehr lebensbedrohlich, da sie den gesamten Organismus betrifft und somit auch einen schwerwiegenden Einfluss auf die Organfunktionen hat, der bis hin zum tödlichen Kreislaufversagen führen kann. Der anaphylaktische Schock und Asthma zählen zu den häufigsten Todesursachen, die in Verbindung mit Lebensmittelallergien vom Soforttyp I gebracht werden können [4]. Derartige extreme Immunantworten werden hauptsächlich durch Erdnüsse hervorgerufen, jedoch treten sie auch gelegentlich bei Eiern, Milch oder Schalentieren auf [17]. Die Fischallergie, welche durch das Allergen Parvalbumin (Muskelprotein) ausgelöst wird, gehört ebenfalls zur 1. Kategorie der Typ – I – Allergien und kann bei den betroffenen Allergikern die beschriebenen Symptome auslösen. Generell kommen IgE – vermittelte allergische Reaktionen häufiger bei Säuglingen und Kleinkindern vor als bei Erwachsenen, wobei genetische Faktoren auf die Entstehung von Typ – I – Allergien einen signifikanten Einfluss haben [17]. In diesem Zusammenhang beschreibt der medizinische Begriff Atopie die erbliche Neigung, auf den Kontakt mit harmlosen Umweltsubstanzen überempfindlich zu reagieren. Demnach existiert bei Allergikern eine körperliche Bereitschaft, Immunglobin E Antikörper in erhöhten Mengen zu bilden, wobei dieser Umstand genetisch verankert ist [17].
Zur 2. Kategorie der Lebensmittelallergien gehört die Zell – vermittelte (Typ IV) „verzögerte Überempfindlichkeitsreaktion“. Hervorgerufen werden diese Allergien in der Regel durch sensibilisierte Immunzellen im Dünndarm, wobei es sich hauptsächlich um Lymphozyten (T – Zellen) handelt, die gegen die entsprechenden allergieauslösenden Substanzen sensibilisiert sind [4]. Die Folge sind Gewebeentzündungen, die sich auf bestimmte Körperbereiche beschränken, und erst 24 h bis 48 h nach der jeweiligen Nahrungsaufnahme (Stoffaufnahme) auftreten [4]. Das bekannteste Beispiel ist die Zöliakie (Glutenunverträglichkeit), bei der die Betroffenen auf Proteine (Prolamine, Gluteline) mit hohem Anteil an Prolin und Glutamin überempfindlich reagieren, was zur chronischen Erkrankung der Dünndarmschleimhaut führt [18]. Ursache dafür ist die Fähigkeit der Proteine, die Epithelzellschicht der Darmschleimhaut bei den erkrankten
Personen zu passieren wodurch das Enzym t-Transglutaminase die Gliadinpeptide modifiziert, und eine lokale Immunreaktion ausgelöst wird, bei der die Aktivierung von T-Lymphozyten erfolgt [18]. Insbesondere in vielen Getreidesorten, wie z. B. in Weizen, Roggen, Gerste oder Hafer, kommt dieses Klebereiweiß (Prolamine / Gluteline) vor und ist bei der Brot – und Gebäckherstellung essentiell für das Teiggerüst bzw. das Gashaltevermögen eines Teiges notwendig [18]. Zöliakie ist die in Europa am häufigsten auftretende genetische Erkrankung mit einer Häufigkeit von 0,3 – 0,5 % [9].
Im Vergleich zu Lebensmittelallergien lassen sich Lebensmittelintoleranzen in 3 Kategorien einteilen. Zur 1. Kategorie gehören die enzymatischen Intoleranzen, bei denen es sich um genetisch bedingte Stoffwechselstörungen handelt [4]. Betroffene Personen sind dabei nicht in der Lage, bestimmte Lebensmittel bzw. deren Inhaltsstoffe zu verstoffwechseln, da spezifische körpereigene Enzyme zum Abbau der Stoffe nicht gebildet werden können. Z. B. sind Laktose intolerante Personen unfähig, den Milchzucker zu metabolisieren, da das intestinale Enzym β – Galaktosidase nicht vorhanden ist [4]. Demnach kann Laktose nicht von den Darmlumen absorbiert werden, was zur Fermentation der Laktose durch die Darmbakterien führt und als Folge bei den Betroffenen schaumige Diarrhoe und Flatulenz auslöst [4]. Die 2. Kategorie der Lebensmittelintoleranzen beinhaltet die pharmakologischen Intoleranzen, bei denen Lebensmittelinhaltsstoffe pharmakologische Wirkungen hervorrufen können. So weisen Betroffene dieser Kategorie eine Intoleranz gegenüber Lebensmitteln auf, die Histamin (Gewebshormon / Neurotransmitter) enthalten oder eine vermehrte Histaminausschüttung im Körper bewirken, wie z. B. Champagner, Rotwein, Schokolade, Tomaten, Thunfisch oder Johannesbeeren [9] [17]. Die Symptome einer pharmakologischen Intoleranz sind u. a. Übelkeit, Erbrechen, Juckreize oder Hautreitzungen [9]. In der 3. Kategorie werden die idiosynkratischen Intoleranzen zusammengefasst, bei denen Lebensmitteln negative körperliche Reaktionen auslösen, der Mechanismus hinter dieser Reaktion jedoch noch ungeklärt bzw. unbewiesen ist [4]. Z. B. sind die genauen Wirkmechanismen für Asthma, das durch den Farbstoff Tartrazin oder durch Sulfite ausgelöst wird, noch nicht eindeutig geklärt [4].
1.1.2 Aufbau & Funktionalität des Immunsystems
Der menschliche Organismus besitzt zum Selbstschutz gegen die pathogene Wirkung von Fremdsubstanzen biologische und chemische Abwehrmechanismen, die harmonisch aufeinander abgestimmt sind und je nach Bedrohungsgrad unterschiedlich reagieren. Auslöser immunologischer Reaktionen sind Antisomatogene (Antigene), da sie auf Grund ihrer körperfremden Struktur durch das menschliche Immunsystem als Gefahr eingestuft werden. Im
Allgemeinen lässt sich das menschliche Abwehrsystem in 3 verschiedene Bereiche einteilen, wobei diese in Tabelle 1 dargestellt sind. [19]
Tabelle 1: Einteilung menschlicher Immunreaktionen (Probst, 2004, S. 267)
Unspezifische Immunreaktion Spezifische Immunreaktion
Passive Resistenz Aktive Resistenz Immunität
Erblich bedingte allgemeine Unempfindlichkeit durch die körperliche Konstitution
Unspezifische Abwehr im Körperinneren durch Proteine und phagocytierende Abwehr-zellen
Im Laufe des Lebens erworbener hochspezifischer Abwehrmechanismus
Die unspezifische Immunreaktion stellt das von Geburt an vorhandene Abwehrsystem dar, um den menschlichen Organismus unspezifisch gegenüber pathogene Erreger zu schützen. Man unterscheidet in die Teilbereiche passive Resistenz und aktive Resistenz. Bei der passiven Resistenz handelt es sich um mechanische, chemische und mikrobielle Mechanismen, die das Eindringen und Wirksamwerden körperfremder Strukturen verhindern sollen. Tabelle 2 gibt dabei eine Übersicht zu den einzelnen Barrieren und ihre Schutzmechanismen. [19]
Tabelle 2: Barrieren der passiven Resistenz (Probst, 2004, S. 268)
Mechanisch Chemisch Mikrobiell
- Haut mit wasserabwei- sender, verhornter toter Außenschicht
- Augenspülung durch Tränenflüssigkeit
- Schleimhäute durch Sekre- tion adhäsiven Schleims
- niedrige pH-Werte auf der Haut (3 – 5 ), im Scheiden- gewölbe (4 – 4,5) und im Magen (1 – 2)
- bakterizide Wirkung des Lysozyms in Tränen – und Speichelflüssigkeit
- Apathogene Bakterien im Mund, Darm sowie auf der Haut bilden Konkurrenzflora
Die aktive Resistenz beinhaltet die „zweite Abwehrreihe“ und verhindert die Vermehrung der Antigene, nachdem diese die Barrieren der passiven Resistenz überwunden haben. In diesem Zusammenhang spielen Mastzellen, Granulocyten, Makrophagen und natürliche Killerzellen eine entscheidende Rolle, da diese mittels Rezeptorerkennung ein breites Spektrum an Erregern identifizieren. Diese unspezifischen Abwehrzellen besitzen eine amorphe Zellgestalt, wodurch sie zwischen dem humoralen Blut – und Lymphsystem wechseln können und somit über
Interzellularräume in der Lage sind, den gesamten Organismus zu kontrollieren. Granulocyten und Makrophagen, auch Fresszellen genannt, stellen das Bindeglied zur spezifischen Immunreaktion dar, auf Grund ihrer Fähigkeit Fremdpartikel sowie pathogene Mikroorganismen mittels Endocytose aufzunehmen und intrazellulär zu verdauen (Vorgang der Phagocytose). Nach diesem Verdauungsprozess werden die antigenen Determinanten (Epitope) der körperfremden Strukturen, bei denen es sich um charakteristische Antigenfragmente handelt, auf der Membranoberfläche der Zellen positioniert, wobei diese Epitope einen Signalcharakter für die spezifischen Immunzellen besitzen, um entsprechende spezifische Immunreaktionen einzuleiten. Abbildung 2 gibt dabei einen allgemeinen Überblick zu den verschiedenen Abwehrzellen und ihrer Entstehung bzw. ihrem Vorkommen [17] [19].
Abbildung 2: Im menschlichen Organismus vorkommende Abwehr - und Immunzellen (Probst, 2004, S. 269)
Die spezifische Immunantwort wird auch als adaptive Immunreaktion bezeichnet, da es sich um eine erworbene Fähigkeit handelt, die erst nach dem Kontakt mit den jeweiligen Antigenen ausgelöst werden kann. Demnach tritt sie in Kraft, wenn die Abwehrreihen der unspezifischen Immunreaktion überwunden worden sind. Die spezifische Immunreaktion lässt sich in die humorale Immunantwort und die zelluläre Immunantwort aufteilen. Beide Abwehrsysteme laufen parallel ab und ergänzen sich nachhaltig in ihrer Wirkungsweise. Demnach umfasst die humorale Immunantwort die Antikörperproduktion in der Lymph – und Blutflüssigkeit gegen die freien Antigene in den Körperflüssigkeiten und wird hauptsächlich über B – Lymphozyten
realisiert. Im Gegensatz dazu beinhaltet die zelluläre Immunantwort die Bildung von Killerzellen gegen Erreger (Antigene), die in Körperzellen eingedrungen sind, und wird hauptsächlich über T – Lymphozyten realisiert. Beide Zelltypen werden in Untergruppen eingeteilt und können anhand ihrer membrangebunden Oberflächenmarker systematisiert werden. Abbildung 3 gibt dabei einen Überblick über die an der spezifischen Immunantwort beteiligten Zelltypen und deren Einteilung. [17] [19]
Abbildung 3: An spezifischer Immunantwort beteiligte Zelltypen (Probst, 2004, S. 271)
Anhand der Abbildung 3 wird ersichtlich, dass sich die T – Lymphozyten in T – Killerzelle, T – Helferzelle und T – Entzündungszelle aufteilen. Die T – Helferzelle sowie die T – Entzündungszelle besitzen als membrangebundenen Oberflächenmarker den CD4 – Rezeptor (Glykoprotein) und sind für die Regulation der Immunantwort durch Ausschüttung von Cytokinen, wie z. B. Interleukine oder Interferon, verantwortlich. Die T – Killerzelle ist mit dem CD8 – Rezeptor ausgestattet, der als Erkennungsmolekül für körpereigene Zellen dient. Demnach ist die Aufgabe der T – Killerzelle die Identifizierung und Zerstörung infizierter Körperzellen bzw. ausgemachter Fremdzellen. Im Gegensatz dazu entwickelt sich die B – Zelle zur Plasmazelle, wobei auf den B – Lymphozyten spezielle Immunglobuline (IgM) als Rezeptoren für Antigenbindungen lokalisiert sind, weshalb ihre Aufgabe die Antigenpräsentation einschließlich der Synthese von Antikörpern ist. [17] [19]
Im Allgemeinen lässt sich die Entwicklung einer spezifischen Immunantwort in verschiedene Phasen unterteilen. In der ersten Phase werden die Antigene, welche nach der Infektion nicht in Wirtszellen eindringen konnten, durch Makrophagen bzw. B – Lymphozyten in den sekundären lymphatischen Organen, wie z. B. Milz, Mandeln oder Lymphknoten, erfasst und mittels Phagocytose aufgenommen. Anschließend erfolgt die Prozessierung (Abbau & Bearbeitung) der Antigene im Zellinneren, wobei die entstehenden kurzkettigen Peptide an MHC – Moleküle gebunden werden. Bei MHC-Komplexen handelt es sich um Gene, die für Gewebeverträglichkeit, Immunerkennung und die immunologische Individualität essentiell sind, da die Genprodukte körpereigene Antigene umfassen und auf der Zelloberfläche zur Identifizierung von Körperzellen lokalisiert sind [20]. Demnach erfolgt der Transfer der antigenen Determinanten / Epitop (Peptid – MHC – Komplex) zur Zelloberfläche, sodass diese den T – Lymphocyten dargeboten werden können. Von den im Blut und Lymphen befindlichen T – Zellen (ca. 100.000) besitzt lediglich eine Zelle den zum Epitop passenden T – Zell – Rezeptor, wobei diese Bindung nach dem Schlüssel – Schloss – Prinzip funktioniert und durch CD4 – bzw. CD8 – Co – Rezeptoren der T – Lymphozyten stabilisiert wird. Im Anschluss daran kommt es zur Differenzierung, d. h. die T – Lymphozyten mit CD8 – Rezeptor entwickeln sich zu Killerzellen und im Gegenzug T – Lymphozyten mit CD4 – Rezeptor zu Helferzellen. Dabei werden die Lymphozyten durch den Kontakt mit mehreren Oberflächenmarkern der Antigen präsentierenden Zelle aktiviert, wobei die interzelluläre Kommunikation über Cytokine (Proteine, Glykoproteide), wie z. B. Interferon oder Interleukine, realisiert wird. An die Differenzierungsphase schließt sich die Klonselektion der T – Zellen an. Das bedeutet, die Teilung der bis dato ruhenden T – Zelle setzt ein, sodass in sehr kurzer Zeit ein Klon erbgleicher Zellen mit höchster Antigenspezifität entsteht und parallel dazu die Synthese der Cytokine gefördert wird. In dieser Phase entsteht ebenfalls das immunologische Gedächtnis (adaptive Immunantwort), da T – und B – Zellen in der Lage sind nach dem Erstkontakt mit Antigenpräsentierenden Makrophagen durch Unterbrechung ihrer Weiterentwicklung zu langlebigen Gedächtniszellen zu werden. Im weiteren Verlauf der spezifischen Immunantwort lagern sich die spezifischen Antikörper, gebildet während der Immunisierung durch B – Lymphozyten, über komplementäre Molekülstrukturen beider Reaktionspartner durch nicht kovalente Bindungen mit den entsprechenden Antigenen zu Antigen – Antikörper – Komplexen zusammen und immobilisieren dadurch die Antigene bzw. bereiten sie für den anschließenden Abbau vor. Zum Abschluss der Immunantwort findet die Lyse der infizierten Körperzellen statt. Dabei werden zunächst die durch Pathogene infizierte Körperzellen anhand ihrer auf der Zellmembranoberfläche befindlichen an MHC – Moleküle gebundenen Epitope (antigene
Determinanten), durch die T – Killerzellen identifiziert. Anschließend binden sich die T – Killerzellen mittels spezifischer Rezeptoren an die infizierte Zelle, wodurch der Kontakt die Freisetzung des in der T – Killerzelle produzierten Perforin bewirkt. Es kommt zur Perforation der Zellmembran, sodass durch die entstandenen Poren Granzyme B (Proteasen) in die Zelle eindringen können und dort eine Apoptose (programmierten Zelltod) auslösen. Die Zelle stirbt ab und wird anschließend aufgelöst. Abbildung 4 dient zur Veranschaulichung des im Vorfeld beschriebenen Vorgangs der spezifischen Immunantwort. [17] [19] [21]
Abbildung 4: Übersicht zur spezifischen Immunantwort im menschlichen Organismus (Probst, 2004, S. 273)
1.1.3 Antikörper
Antikörper sind quartär strukturierte Glykoproteine aus der multigenen Proteinfamilie der Immunglobuline und spielen eine essentielle Rolle bei der menschlichen Immunabwehr gegen pathogene Fremdsubstanzen bzw. körperfremde Strukturen. Die Einteilung der Immunglobuline (Antikörper) erfolgt in 5 Hauptklassen (Isotypen), die man anhand von Größe, Ladung, Aminosäurezusammensetzung und Kohlenhydratgehalt unterscheiden kann. Die Bezeichnung der einzelnen Klassen ist IgG, IgM, IgA, IgD und IgE. Anhand von Abbildung 5 soll der allgemeine Grundaufbau der Immunglobuline und die daraus resultierenden Funktionalität am Beispiel des Immunglobulins G (IgG) erläutert werden. [19] [22]
Abbildung 5: Aufbau der Antikörpergrundstruktur (IgG) (Wild, 2001, S. 119)
Im Allgemeinen setzen sich Antikörper aus 2 identischen schweren Polypeptidketten („Heavy Chains“) und 2 identischen leichten Polypeptidketten („Light Chains“) zusammen. Die beiden schweren Ketten sind über Disulfidbrückenbindungen mit einander verlinkt, wobei jede schwere Kette ebenfalls über eine Disulfidbrücke mit einer leichten Kette verbunden ist. Daraus ergibt sich eine flexible Y – Form des Proteinmoleküls. Des Weiteren sind die schweren Ketten unterteilt in 3 konstante (CH1, CH2, CH3) sowie 1 variable (VH) Domäne. Die leichten Ketten gliedern sich in 1 konstante (CL) und 1 variable (VL) Domäne. Dabei bestehen die einzelnen Domänen aus schätzungsweise 110 Aminosäuren. Die hohe Spezifität der jeweiligen Antikörper ergibt sich aus der Strukturvielfalt (Sequenzvielfalt der AS) der variablen Domänen VL und VH,
die sich am Ende der jeweiligen Kette befinden und das Fv-Fragment bilden. Innerhalb der beiden variablen Domänen (VL/VH) sind jeweils 3 hypervariable AS – Sequenzbereiche, die auch als CDR („Complementarity Determining Region“) bezeichnet werden und eine β – Faltblattstruktur aufweisen. Letztendlich bilden diese 6 CDR pro Antikörperarm die spezifische Antigenbindungsstelle, wonach jeder Antikörper 2 identische Bindungsstellen für Antigene besitzt. Die Funktionalität der Antikörper bzw. die unterschiedlichen Effektormechanismen der einzelnen Isotypen werden über die variierenden Fc – Regionen, die sich am unteren schweren Kettenende (CH2, CH3) befinden, realisiert. Man unterscheidet dabei in 5 Hauptarten schwerer Ketten bzw. Fc – Regionen, die durch entsprechende Fc – Rezeptoren (Membranrezeptoren) gebunden werden können und dadurch die spezifischen Eigenschaften der verschiedenen Immunglobuline bestimmen. Dabei handelt es sich um die Domänen Fcα (IgA), Fcγ (IgG), Fcε (IgE), Fcδ (IgD) und Fcμ (IgM). Z. B. ist der Fcε – Rezeptor auf der Membranoberfläche von Mastzellen zu finden und bindet die Fc – Domäne des IgE, sodass die Mastzelle aktiviert wird, sobald sich Antigene an den IgE Antikörper binden. Dieser Vorgang ist insbesondere bei IgE vermittelten Immunantworten (Typ – I – Allergien) relevant. [17] [19] [22]
Im oberen Teil wurde bereits erwähnt, dass insgesamt 5 Immunglobulinklassen existieren, die unterschiedliche Funktionen bei der Immunabwehr des Menschen übernehmen und teilweise in weitere Unterklassen aufgegliedert werden können. Bei den Immunglobulinen der Klasse IgM und IgD handelt es sich um Monomere, die auf der Zelloberfläche von B – Lymphozyten lokalisiert sind und die Funktion antigenspezifischer Rezeptoren ausführen. Des Weiteren ist IgM dazu in der Lage, durch Polymerisation Pentamere zu bilden, was die eigentlich IgM – Struktur im Blutserum widerspiegelt. Generell besitzen die variablen Domänen des IgM eine geringe Bindungsaffinität gegenüber Antigenen, jedoch ist die Bindungsstärke auf Grund der hohen Anzahl an Bindungsstellen (10) in der Pentamerform sehr ausgeprägt. Insbesondere in der Frühphase der Immunatwort tritt IgM vorwiegend auf, wobei im weiteren Verlauf IgG, IgA bzw. im Falle einer allergischen Immunreaktion IgE Antikörper den größten Anteil darstellen. Dieses Phänomen wird als Isotypen – Klassenwechsel bezeichnet und beinhaltet eine DNA bedingte Umstellung der Gene, die für die Synthese der konstanten Domänen der schweren Polypeptidketten zuständig sind. Das heißt, es existieren unterschiedliche Isotypen mit der gleichen Antigenspezifität, da die variablen Domänen unverändert bleiben. Gesteuert wird dieser Prozess durch die T – Zellen und die Sekretion der entsprechenden Cytokine, wie z. B. Interleukin – 4 (IL – 4), das die B – Lymphozyten auf die IgE Produktion umstellt. Das bereits erwähnte IgG besitzt eine monomere Struktur und ist das am häufigsten im Blutserum vorkommende Immunglobulin mit einem Anteil von 70 – 75%. IgG wird zudem in 4
Unterklassen aufgeteilt, die sich durch strukturelle Unterschiede im Aufbau der schweren Polypeptidketten zueinander unterscheiden. Des Weiteren wird IgG als der wichtigste Antikörper der Sekundärreaktion (Immunantwort) beschrieben, wobei die Unterklassen IgG1 sowie IgG3 plazentagängig sind und eine passive Immunisierung des Fötus bewirken. Der Antikörper IgA stellt mit einem Blutserumanteil von 15 – 20% neben dem IgG das zweithäufigste Immunglobulin im menschlichen Organismus dar und ist ebenfalls in Tränenflüssigkeit und intestinalen Sekreten wie Speichel nachweisbar. Zudem ist IgA in der Lage, durch Polymerisation Diamere zu bilden und verfolgt als hauptsächliches Ziel, die Anheftung von Bakterien oder Viren an Epitheloberflächen zu verhindern, sodass eine Infektion humoraler Zellen unmöglich bzw. eingeschränkt wird. Beim letzten Isotyp handelt es sich um den IgE Antikörper, der bei allergischen Immunreaktionen involviert ist und bei Immunantworten gegenüber Parasiten (z. B. Würmern) eine entscheidende Rolle spielt. Die schwere Polypeptidkette dieses Antikörpers besitzt eine zusätzliche konstante Domäne (CH), wodurch die Fcε – Region mit hoher Affinität an den Fcε – Rezeptoren auf den Mastzellen, basophilen Granulozyten (enthalten Histamin, Heparin) sowie auf eosinophilen Granulozyten binden kann. Zudem kann diese Bindung über mehrere Jahre aktiv bleiben, sodass bei der entsprechenden Antigenaufnahme der Antigen – Antikörper – Komplex die Mastzelle zur Ausschüttung allergieauslösender Stoffe, wie z. B. Histamin, veranlasst. [17] [19]
1.1.4 Immunologische Mechanismen allergischer Reaktionen
Im Allgemeinen existieren 4 Allergietypen, bei denen die spezifischen Immunreaktionen entweder durch Antikörper (Allergietypen I – III) oder durch T – Zellen übertragen werden (Typ IV – Allergie). Im Falle der Fischallergie, die zu den Typ I – Allergien zählt, wird die Immunreaktion durch IgE Antikörper vermittelt. [23] Generell läuft die Entwicklung einer Lebensmittelallergie (Soforttyp – I) in 2 Phasen ab, wobei die 1. Phase als Sensibilisierung und die 2. Phase als Erhebung bzw. Effektorphase bezeichnet wird. Anhand von Abbildung 6 soll der Prozess näher erläutert werden [17].
Abbildung 6: Entstehungsprozess einer IgE vermittelten Typ-I-Allergie (Probst, 2004, S.279)
In der Sensibilisierungsphase kommt es zunächst zum 1. Kontakt zwischen den entsprechenden Antigenen, meist einem natürlichen in der Nahrung vorkommenden Protein (Parvalbumin bei Fisch) und den B – Lymphozyten. Die Antigene binden dabei zunächst an die auf der Membranoberfläche der B – Lymphozyten befindlichen IgM/IgD Antikörper, wodurch der Antigen – Immunglobulin – Komplex anschließend intern abgebaut wird. In Folge dessen kommt es zur Bindung der Peptid Segmente an die entsprechenden MHC – Moleküle, sodass diese präsentiert und durch die jeweiligen T – Helferzellen anhand des passenden Epitops identifiziert werden. In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, dass man in 2 Arten von T – Helferzellen differenziert. Zum einen gibt es die Th1 CD4+ - Zellen, deren Eigenschaften die Interferon – γ Ausschüttung sowie die IgG vermittelte Zerstörung intrazellulärer Bakterien und Pilze ist. Des Weiteren sind durch Th1 – Zellen unangemessen ausgelöste Immunantworten die Grundlage für die Entstehung von Typ – IV Allergien (z. B. Zöliakie). Andererseits gibt es die Th 2 CD4+ - Zellen, die vorwiegend Interleukin (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13) als Botenstoff ausschütten und für die IgE vermittelte Zerstörung von Parasiten (Würmern) verantwortlich sind. Diese Th 2 – Zellen sind ebenfalls einer der Hauptgründe für die Entstehung von IgE vermittelter Lebensmittelallergien, da sie in der Sensibilisierungsphase die Isotypen – Umstellung der B – Lymphozyten bewirkt. D. h. nachdem der T – Zell – Rezeptor an das MHC – Peptidsegment (Antigenfragment) auf der B – Zelle gebunden hat, kommt es zur zusätzlichen Ausschüttung von Th 2 Cytokinen (IL-4, IL-13). Dadurch erfolgt zunächst die Entwicklung der B – Zelle zur
Plasmazelle, die anschließend in der Lage ist, IgE – Antikörper zu produzieren. Demnach ist die unangemessene Immunreaktion der Th 2 – Zellen gegenüber harmlosen Proteinen eine der Hauptursachen für IgE vermittelte Lebensmittelallergien. Im weiteren Verlauf der Sensibilisierungsphase kommt es zur Bindung des IgE – Antikörpers an den Fcε – Rezeptoren auf den Mastzellen. Wie bereits unter Punkt 1.1.3 beschrieben, besitzen die Immunglobuline E
Fcε – Domänen sowie eine zusätzliche konstante Domäne (CH), wodurch eine hohe
Bindungsaffinität zum Mastzellenrezeptor (Fcε) besteht und daraus eine lange Bindungsdauer resultiert. Die Bindung der IgE Antikörper an die Mastzellen bildet dabei den Abschluss der Sensibilisierungsphase, wobei der menschliche Körper nun gegen diese Antigene sensibilisiert ist. [17] Während dieser Phase treten in der Regel keine Symptome einer allergischen Abwehrreaktion auf [4].
In der 2. Phase, auch als Effektorphase bezeichnet, kommt es im Falle einer erneuten Antigenaufnahme zur Kreuzvernetzung zwischen den auf der Mastzelle befindlichen IgE – Antikörpern und den spezifischen Antigenen, wobei das Antigen für eine erfolgreiche Querverbindung an beide Epitope (linker-rechter Arm) des IgE – Antikörpers binden muss, um eine ausreichende Mastzellstimulation zu erreichen [24]. Die Vernetzung bewirkt eine Konformitätsänderung des Antigen – Antikörperkomplexes, wodurch Calcium-Ionen in die Mastzelle strömen und diese dadurch aktiviert wird. In Folge dessen tritt die exocytotische Freisetzung (Degranulation) der Mediatoren, die in den Granula der Mastzellen gespeichert sind, ein. Bei diesen Mediatoren bzw. Botenstoffen handelt es sich vorwiegend um Histamin, Serinproteasen, Proteoglykane, Leukotricine und Serotonin. Innerhalb der Degranulation binden die Proteoglykane ionisch an das Histamin und die Serinproteasen, wodurch eine kristalline Struktur entsteht, die eine erhöhte Löslichkeit aufweist (solubilisiert). Die Freisetzung der Mediatoren erfolgt in kürzester Zeit nach dem Kontakt zwischen Antigen und IgE – Antikörper und bewirkt im Organismus die Auslösung schwerwiegender allergischer Symptome. Histamin ist dabei für Bronchokonstriktion (Verengung der Atemwege), Schleimsekretion, Vasodilatation (Erweiterung der Blutgefäße), Juckreiz, Nesselsucht sowie Gewebeschwellungen durch Wassereinlagerungen (Ödem) verantwortlich, wobei im schlimmsten Fall ein anaphylaktischer Schock ausgelöst werden kann. [17] Leukotricine hingegen zählen zu den Mediatoren, die allergische Symptome langsamer entwickeln lassen, wie z. B. verzögerte asthmatische Reaktionen [4]. Letztendlich ist die Ausprägung allergischer Symptome hauptsächlich von der Antigenmenge, der IgE – Konzentration im Körper und der Bindungsaffinität des Antigens abhängig [17].
1.1.5 Allergene & Fischallergen Parvalbumin
Im Allgemeinen handelt es sich bei Lebensmittelallergenen um Substanzen, die mit IgE – Antikörpern reagieren, eine allergische Sensibilisierung sowie eine allergische Immunantwort hervorrufen. Letztendlich müssen alle 3 Kriterien durch das Allergen erfüllt werden, sodass die Bezeichnung „komplettes Allergen“ zutrifft. Im Gegensatz dazu handelt es sich um „unvollständige Allergene“, wenn die Kriterien lediglich zum Teil erfüllt werden. Dabei unterscheidet man in „Nicht – Allergieauslöser“, die lediglich mit IgE – Antikörpern reagieren ohne eine allergische Sensibilisierung oder Immunreaktion auszulösen, und in „Nicht – Sensibilisierungsauslöser“, die ebenfalls mit IgE – Antikörpern reagieren, jedoch eine allergische Immunreaktion auslösen, ohne selbst am Sensibilisierungsvorgang beteiligt zu sein. Im Falle der 1. Gruppe („Nicht – Allergieauslöser“) weisen einige pflanzliche und tierische Glykoproteine die Eigenschaft auf, mit auf den Mastzellen befindlichen IgE – Antikörper zu reagieren, jedoch bleibt eine Stimulation (Degranulation) der Mastzellen aus, da sie auf Grund ihres monovalenten Charakters lediglich mit einem Epitop der IgE – Antikörper reagieren und letztendlich keine Kreuzvernetzung der IgE – Rezeptoren bewirken. Glykoproteine werden auch als Hapten – Träger – Komplexe bezeichnet, wobei Haptene Substanzen darstellen, die lediglich mit einem entsprechenden Protein – Trägermolekül allergieauslösend sind. Im Gegensatz dazu sind bei der 2. Gruppe („Nicht – Sensibilisierungsauslöser“) Substanzen durch Kreuzreaktivität in der Lage, allergische Immunreaktionen zu bewirken, ohne vorher selbst eine IgE – Produktion zu induzieren. Zum Beispiel existiert eine Kreuzreaktivität zwischen dem Birkenpollenallergen und dem Apfelallergen. Das Pollenallergen löst dabei den Sensibilisierungsprozess im Organismus aus, sodass IgE – Antikörper durch Plasmazellen produziert werden. Demnach kommt es bei der Aufnahme des Apfelallergens zur Kreuzreaktivität zwischen den Bindungsstellen der IgE – Antikörper auf den Mastzellen und denen des Allergens auf Grund ähnlicher bzw. identischer Eigenschaften der Epitope vom Pollenantigen und Apfelantigen. In Folge dessen wird die Degranulation der Mastzelle hervorgerufen und diese initiiert eine allergische Immunreaktion. [24]
Das Fischallergen Parvalbumin erfüllt die Kriterien eines „kompletten Allergens“ und ist demnach in der Lage, den Sensibilisierungsprozess sowie die Immunreaktion beim 2. Kontakt auszulösen [24]. Parvalbumin gehört zur Klasse der tierischen Lebensmittelallergene, im Speziellen zu den Calcium-bindenden EF – Hand – Proteinen, wobei EF – Hand für eine spezifische Proteindomäne (Aminosäuresequenz) steht [4]. Auf Grund dieser Struktureigenschaft besitzt Parvalbumin eine hohe Affinität gegenüber Ca2+ und Mg+. Insbesondere im weißen Muskelfleisch niederer Wirbeltiere, wie z. B. im Kabeljau, Seelachs oder Flunder, kommt
Parvalbumin in höheren Mengen vor. Im Gegensatz dazu tritt Parvalbumin im dunklen (roten) Muskelfleisch, wie z. B. im Thunfisch oder Schwertfisch, oder in der Skelettmuskulatur höherer Wirbeltiere in geringeren Konzentrationen auf, sodass im Falle der genannten Fischarten ein geringeres allergisches Potential besteht. Des Weiteren ist Parvalbumin insbesondere am Prozess der Muskelentspannung beteiligt, da es Ca2+ Ionen zwischenspeichert und von den Myofibrillen (Funktionseinheit in Muskelzelle) zum Sarkoplasmatischen Retikulum transportiert. Dort erfolgt die Speicherung der Ca2+ Ionen, sodass beim Eintreffen eines Aktionspotenzials die Ionen erneut in die Myofibrillen diffundieren und die Muskelkontraktion auslösen. [10] Generell ist die Parvalbuminstruktur in verschiedenen Fischarten sehr ähnlich bzw. als homolog anzusehen, sodass eine Kreuzreaktivität der IgE – Antikörper gegenüber unterschiedliche Fischarten besteht. Zudem wurde festgestellt, dass sich die Parvalbumin Isotypen unter den Fischen einer Art unterscheiden, wobei diese differenzierte Expression der Parvalbumin Isotypen auf die entsprechenden physiologischen Anforderungen während der Wachstumsphase zurückzuführen ist. [25] Anhand von Abbildung 7 soll die Parvalbuminstruktur, insbesondere das EF – Hand – Motiv, näher erläutert werden.
Abbildung 7: Karpfenparvalbumin mit 2 Calcium-bindenden Seiten (lila markiert) (Breiteneder, 2005, S. 16)
Wie bereits im Vorfeld erwähnt, gehört Parvalbumin zur Calcium – bindenden Proteinfamilie der EF – Hand. Hinter dieser Bezeichnung verbirgt sich der strukturelle Aufbau einer Calcium – bindenden Domäne die aus 2 α – Helix besteht, die über eine β – Schleife (Calcium – bindend) miteinander verbunden sind. Dabei stellt das EF – Hand – Motiv, auch als Helix – Turn – Helix – Motiv (HTH) bezeichnet, ein sekundäres Proteinstrukturelement dar. Des Weiteren handelt es sich bei den EF – Hand Proteinen um die ersten intrazellulären Calcium – bindenden Proteine, die identifiziert und charakterisiert worden sind, zumal neben Parvalbumin ebenfalls Troponin C (in Skelett – und Herzmuskel), Calbindin (Transportprotein) oder die Leichte – Myosinkette (Motorprotein z. Bewegungserzeugung) in diese Kategorie gehören. [26] Das Fischallergen Parvalbumin setzt sich aus 3 EF – Hand – Motiven zusammen, wobei 2 dieser Motive (Motivdomänen) Calcium – bindend und in Abbildung 7 lila gefärbt sind. Das 3. EF – Hand – Motiv im Parvalbumin stellt eine „inaktive Domäne“ dar, die eine Art Schutzkappe bildet und die hydrophobe Oberfläche der beiden aktiven Domänen abdeckt. Auf Grund seiner Struktur und den daraus resultierenden chemischen Eigenschaften weist das Fischallergen eine hohe Resistenz gegenüber Hitze, chemischer Denaturierung sowie proteolytischem Enzymabbau auf. [27] Außerdem wurde festgestellt, dass Parvalbumin selbst nach Hitzeeinwirkungen von 90°C seine Struktur nur teilweise verliert bzw. die Strukturveränderung reversibel ist, sodass das allergische Potenzial bestehen bleibt. Besonders für von einer Fischallergie betroffene Allergiker ist dieser Umstand sehr kritisch, da es keine effiziente Möglichkeit gibt, Parvalbumin vollständig zu inaktivieren. [28] Des Weiteren besitzt Parvalbumin ein geringes Molekulargewicht zwischen 10 – 12 kDa, weist eine hohe Wasserlöslichkeit auf und der Isoelektrische Punkt liegt im Bereich 3,9 (Karpfen) – 6,6 (Lungenfisch) [10] [26].
1.1.6 Rechtliche Rahmenbedingungen zur Kennzeichnungspflicht von Allergenen
Allergiker müssen bei der Nahrungsaufnahme darauf achten, dass die von ihnen verzehrten Produkte keine Lebensmittelallergene enthalten, da bereits geringe Spuren der entsprechenden Substanzen lebensbedrohliche Immunreaktionen auslösen können. Im Fall einer Fischallergie haben Untersuchungen ergeben, dass bereits Immunreaktionen bei 1 mg Fischprotein / kg Nahrungsmittel verursacht werden, wobei die allergieauslösenden Proteinkonzentrationen unter Allergikern stark schwanken (1mg/kg – 100mg/kg), da genetische und physiologische Faktoren einen signifikanten Einfluss darauf haben [29]. Demnach sind Allergiker bei der Lebensmittelauswahl auf die eindeutige Kennzeichnung von allergenenthaltenden Lebensmitteln
durch die Lebensmittelhersteller angewiesen, wobei die rechtlichen Grundlagen durch den Gesetzgeber bestimmt werden müssen.
Die Grundlage für die Kennzeichnung von Lebensmitteln bildet die Richtlinie 2000/13/EG vom 20. März 2000 „zur Angleichung der Rechtsvorschriften der Mitgliedsstaaten über die Etikettierung und Aufmachung von Lebensmitteln, sowie die Werbung hier“. Des Weiteren wird die Allergenkennzeichnung durch diese Richtlinie und insbesondere durch die entsprechenden Änderungen in den Richtlinien 2003/89/EG vom 10.11.2003, 2006/142/EG vom 22.12.2006 und 2007/68/EG vom 27.11.2007 geregelt. Im Anhang IIIa der Richtlinie 2003/89/EG wurden 12 Produktgruppen aufgelistet, die eine allergische Immunreaktion auslösen, weshalb diese Produkte sowie die daraus hergestellten Lebensmittel kennzeichnungspflichtig sind. Im weiteren Verlauf wurden diese Produktgruppen in der Richtlinie 2006/142/EG um die Gruppen Lupine und Weichtiere (Krebstiere) ergänzt, wobei diese im Anhang IIIa der Richtlinie 2007/68/EG aufgeführt werden und ebenfalls als kennzeichnungspflichtig einzustufen sind. Die von der EU erlassenen Richtlinien mit den jeweiligen Vorgaben wurden in die deutsche Lebensmittelkennzeichnungsverordnung (LMKV) aufgenommen. Damit ist die Allergenkenn-zeichnung für die Lebensmittelindustrie seit 2005 gesetzmäßig festgelegt. Dadurch soll der Verbraucherschutz erhöht und insbesondere Personen, die an einer Lebensmittelallergie bzw. Lebensmittelunverträglichkeit leiden, besser über Produktinhaltsstoffe informiert werden. [9] Problematisch ist jedoch, dass es keine gesetzlichen Grenzwerte für Allergene der 14 Produktgruppen gibt, Gluten (20 mg/kg) und Sulfit (10 mg/kg) ausgeschlossen, da die wissenschaftlichen Daten zu allergieauslösenden Lebensmitteln noch unzureichend sind, um fundierte Schwellenwerte zu definieren. Diesbezüglich wurden durch das BfR und MRI verschiedene internationale Modelle, wie z. B. das australische VITAL – Konzept oder das ECARF – Konzept, hinsichtlich der Festlegung von Schwellenwerten zur Allergenkenn-zeichnung überprüft und als unzureichend bewertet, da die wissenschaftliche Datenlage derzeit nicht ausreicht und demnach weitere Forschungen notwendig sind. Im Falle einer zwingend erforderlichen Festlegung von vorläufigen Schwellenwerten empfiehlt das BfR und MRI nach derzeitiger wissenschaftlicher Lage einen allergenspezifischen Bereich von 0,01% - 0,001% allergener Inhaltsstoff pro fertigem Lebensmittel zu definieren. [29]
Eine weitere Problematik sind Kreuzkontaminationen im Herstellungsprozess, z. B. durch den Einsatz kontaminierter Rohstoffe oder durch Verschleppung auf Grund unzureichender Reinigungsmaßnahmen, nicht in den Richtlinien berücksichtigt worden. Generell sind Kreuzkontaminationen nach heutigem Stand der Technik bei der industriellen Herstellung nicht vermeidbar, wodurch der Hersteller keine 100% allergenfreien Produkte deklariert, sofern eine
Kreuzkontamination bei den jeweiligen Produkten nicht ausschließbar ist. Z. B. sind geringe Spuren von Nüssen in Vollmilchschokolade nicht auszuschließen, wenn in dem Betrieb Schokoladenprodukte mit Nüssen hergestellt werden. Deshalb gibt es auf vielen Packungen die freiwilligen und vorsorglichen Warnhinweise „Kann Spuren von…enthalten“ oder „Spuren:…“, sodass letztendlich die rechtliche Haftung des Produzenten beschränkt wird. Grund dafür ist, dass der Lebensmittelhersteller für fehlerhafte oder falsche Allergenkennzeichnungen auf Verpackungen, die eine Gesundheitsschädigung des Verbrauchers zur Folge haben, haftet, soweit der Verbraucher die Kennzeichnungsfehler beweisen kann. Rechtlich relevant ist in diesem Falle das Produkthaftungsgesetzt, insbesondere §3 Abs. 1 a, der Produktfehler im Sinne der fehlerhaften Darbietung einer Allergenkennzeichnung beinhaltet, zu denen auch Warnhinweise zählen, die nicht den gesetzlichen Anforderungen entsprechen. [9] Dabei spielt insbesondere die aktuelle EU – Verordnung Nr. 1169/2011 vom 22.11.2011 eine entscheidende Rolle, da sie die Allergenkennzeichnung auf europäischer Ebene neu regelt, wobei z. B. allergieauslösende Inhaltsstoffe im Zutatenverzeichnis besonders hervorgehoben werden müssen (z. B. durch Schriftart oder Farbe). Zudem muss zukünftig auch unverpackte Ware (z. B. Bedienthekenbereich) entsprechend gekennzeichnet werden. [30] Grundsätzlich meiden Allergiker jedoch Verpackungen, die mit entsprechenden Warnhinweisen gekennzeichnet sind, zumal die vorsorgliche Deklaration durch die Hersteller steigt. Einerseits wird dadurch die Auswahl an Lebensmitteln für betroffene Personen immer geringer und andererseits verliert die Industrie potentielle Käufer für ihre Produkte, wodurch Umsatzeinbußen entstehen. [9]
1.2 Immunchromatographische Anaylseverfahren
1.2.1 Allgemein
Zur Kategorie der immunologischen Testverfahren zählen, neben dem LFA, auch ELISA oder die SPR Biosensoren (SPR Immunoassay). Im Allgemeinen basieren diese Testverfahren auf der Wechselwirkung zwischen einem selektiven Antikörper und dem jeweiligen Zielanalyten (Antigen), wobei diese zusammen einen Antigen – Antikörper – Komplex bilden. Die immunologische Reaktion kann dabei z. B. über Enzymmarkierungen (Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase) im Fall des ELISA – Verfahrens oder durch Radionuklide (I125) im Fall des radioimmunologischen Verfahrens sichtbar gemacht werden. Neben den genannten Markierungsmöglichkeiten existiert eine Vielzahl weiterer Visualisierungsmethoden, wie z. B. Fluoreszenzpolarisation, Chemolumineszenz oder elektrochemische Detektionsmethoden (Impedanzmessung) im Fall von SPR – Biosensoren. Grundsätzlich unterscheidet man die
immunologischen Verfahren in heterogene und homogene Immunassays. Bei den heterogenen Analyseverfahren wird ein Immunreagenz auf einer Festphase, wie z. B. Latexkugeln, Magnetpartikeln, Mikroplatten, Teströhrchen oder Filterpapier, immobilisiert und anschließend erfolgt durch einen Waschschritt die Trennung gebundener und freier Reagenzien. Im Gegensatz dazu findet die Immunreaktion bei homogenen Immunassays in Lösung statt, wodurch kein weiterer Waschschritt notwendig ist. Die Störanfälligkeit der homogenen Reaktion ist jedoch auf Grund von Matrixinterferenzen höher. [31]
Die einzigartige Charakteristik der immunologischen Testverfahren wird durch 3 entscheidende Antikörpereigenschaften geprägt. Eine dieser Eigenschaften ist die hohe Bindungsspezifität des Antikörpers gegenüber den jeweiligen Antigenen, sodass in Anwesenheit verschiedener Substanzen die Zielanalyten selbst in sehr geringen Konzentrationsbereichen (10-12 [pg]) detektierbar sind. Zudem existiert zwischen Antikörpern und Antigenen eine hohe Bindungsstärke (nicht – kovalente Bindung), die dazu beiträgt, dass die gebildeten Komplexe die Signalentwicklung bzw. das Testverfahren überstehen und demnach sehr präzise im niedrigen Konzentrationsbereich gearbeitet werden kann. Zusätzlich ist das weite Bindungsspektrum der Antikörper sehr vorteilhaft, da diese in der Lage sind, an die unterschiedlichsten Chemikalien (natürliche/künstliche), Biomoleküle, Zellen oder Viren zu binden. Auf Grund dieser Tatsachen ist die Bindungskinetik von Antikörper – Antigen Wechselwirkungen für die immunchromatographischen Testverfahren sehr wichtig, da sie ausschlaggebend für die Entwicklung effizienter Analyseverfahren ist. Dabei beeinflussen verschiedene Faktoren, wie z. B. der pH – Wert, Temperatur, Reaktionszeit oder Pufferkonzentration (Ionenstärke) diese Gleichgewichtsreaktion. [22]
Im Allgemeinen sind für analytische Methoden, insbesondere bei denen, die für den Nachweis gesundheitsschädigender Substanzen in Lebensmitteln eingesetzt werden, z. B. zum Nachweis von Allergenen, Pestiziden oder Mykotoxinen, die aufgeführten Faktoren essentiell:
¾ zufriedenstellende Sensitivität - Detektionsbereich mg/kg - μg/kg
¾ ausreichende Spezifität - Detektion in komplexen Matrizen
¾ schnelle Detektion - kurze Analysezeit
¾ einfache Handhabung - keine Fachleute notwendig
Die existierenden immunologischen Testverfahren erfüllen die Anforderungen zum großen Teil, jedoch ist insbesondere der Faktor der einfachen Handhabung problematisch, da sehr häufig geschultes Fachpersonal zur Durchführung notwendig ist. Im Fall von forschungsunabhängigen
Anwendungen also für den „Heimgebrauch“ oder für industrielle Anwendungszwecke („Vor – Ort – Schnelltests, z. B. zur Verbesserung des Verbraucherschutzes oder zur Einhaltung der Qualitätsanforderungen, sind viele immunologische Testverfahren ungeeignet. [4]
1.2.2 Lateral Flow Assay
Das immunchromatographische Testverfahren Lateral Flow Assay erfüllt die im Vorfeld aufgeführten Anforderungen und zeichnet sich zusätzlich durch eine hohe Zuverlässigkeit und geringe Kosten aus. Grundsätzlich basiert das LFA – Verfahren auf spezifischen Wechselwirkungen zwischen Antikörper – Antigen, wobei die Visualisierung des Testergebnisses über den Einsatz von Markern realisiert wird. Dabei handelt es sich vorwiegend um farbige oder fluoreszierende Nanopartikel, wie z. B. kolloidales Gold, Latex, Karbon oder Liposome. Letztendlich handelt es sich beim LFA um Teststreifen, die aus einem Trägermaterial bestehen, auf dem verschiedene Antikörper (sAK, pAK, IgG) immobilisiert sind, wobei der Teststreifen durch das Auftragen der flüssigen Probe aktiviert wird. Die LFA – Methode wird für qualitative sowie semiquantitative Nachweise als Vor – Ort – Schnelltest in vielen Einsatzbereichen angewendet, wie z. B. zum Nachweis von Pathogenen, Hormonen (Schwangerschaftstest), Drogen, Metaboliten in der Medizin oder Allergenen (Erdnussprotein etc.) in der Lebensmittelbranche. [32]
2. Material & Methoden
2.1 Chemikalien & Equipment
Für die Experimente zur Entwicklung eines LFA zum Nachweis von Fischallergenen werden die im Anschluss aufgeführten Chemikalien und Geräte verwendet.
2.1.1 Chemikalien
Zur Herstellung der jeweiligen Pufferlösungen werden die folgenden Reagenzien verwendet: x Sodium tetraborate, Lot. A0237931, ACROS Organics, USA
x Natriumhydrogenphosphat, Lot. A925646638, Merck, Germany x Di – Natriumhydrogenphosphat, Lot. F529186905, Merck, Germany x Natriumchlorid, Lot. 161169881, Carl Roth GmbH, Germany
x Natronlauge 0,1 M, Lot. 0638/08/10, Carl Roth GmbH, Germany
Bei der Herstellung aller weiteren benötigten Lösungen werden folgende Chemikalien eingesetzt:
x Succrose, Lot. 1260903, SIGMA – Aldrich Chemie GmbH, Switzerland x Dextran 35, Lot. 3707873, Carl Roth GmbH, Germany
x BSA (further purified fraction V), Lot. 027K0740, SIGMA –Aldrich Inc., USA x Casein Sodium Salt, Lot. 10K0198, SIGMA – Aldrich Chemie GmbH,
Switzerland
x Tween 20, Lot. BCBF7669V, SIGMA – Aldrich Chemie GmbH, Switzerland x Polyvinylpyrrolidone (PVP), Lot. 013K0049, SIGMA – Aldrich Chemie GmbH,
Switzerland
x Natriumazid, Lot. 25358170, Carl Roth GmbH, Germany x Kaliumcarbonat, Lot. A258946657, Merck, Germany
x Kolloidale Goldlösung ø 40 nm (OD 1,1), Lot. 8818, BB International, UK
2.1.2 Puffer & Lösungen
Während der Experimente werden die aufgeführten Pufferlösungen verwendet: x 5 mM Boraxpuffer (pH 9,0)
x 100 mM PBS (pH 7,4) x 40 mM PBS (pH 7,4) x 100 mM PB (pH 7,4) x 10 mM PB (pH 7,0)
Für die Herstellung des 5 mM Boraxpuffers (pH 9,0) wird Sodium tetraborate in destilliertem Wasser gelöst und anschließend der pH – Wert mit 0,1 M Natronlauge auf 9,0 eingestellt. Die Herstellung des 100 mM PBS (pH 7,4) erfolgt durch das Mischen von Natrium-hydrogenphosphat und Di – NatriumNatrium-hydrogenphosphat. Dabei werden zunächst separat 13,9 g des einbasischen Natriumhydrogenphosphats in 500 ml destilliertem Wasser und 28,4 g des zweibasischen Di – Natriumhydrogenphosphats in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst. Anschließend werden 600 ml destilliertes Wasser mit 48 ml einbasischer Lösung und 252 ml zweibasischer Lösung kombiniert, sodass 100 mM PB (pH 7,5) entsteht. Durch die Zugabe von 8 g NaCl auf 1000 ml PB (pH 7,5) bildet sich 100 mM PBS (pH 7,4). Bei der Herstellung des 10 mM PB wird zunächst 100 mM PB (pH 7,0) durch das Mischen von 600 ml dest. Wasser mit 117 ml einbasischer Lösung und 183 ml zweibasischer Lösung hergestellt. Anschließend erfolgt die Verdünnung mit Reinstwasser auf 10 mM PB (pH 7,0). Alle hergestellten Pufferlösungen werden mit Filterpapier (ø 0,45 μm, Schleicher & Schnell, Lot.: DC 0406-1) gefiltert.
Während der Herstellung des Antikörper – Nanogold – Konjugats werden die aufgeführten Lösungen verwendet:
x 100 mM Kaliumcarbonatlösung (pH 11,2) in Reinstwasser x 10% BSA in 5 mM Boraxpuffer (pH 9,0)
Des Weiteren werden die folgenden Lösungen zur Vorbehandlung der einzelnen LFA – Komponenten eingesetzt:
x Membranblocker:
o 5% Succrose in 10 mM PB – Puffer (pH 7,0) o 1% BSA in 100 mM PBS – Puffer (pH 7,4) o 1 % PVP in 100 mM PBS – Puffer (pH 7,4)
o 2% Casein in 100 mM PBS – Puffer (pH 7,4) x Konjugatpad:
o 0,5% Casein + 0,5 % Tween 20 in 100 mM PBS (pH 7,4) o 0,5 % BSA + 0,2% Tween 20 in 40 mM PBS (pH 7,4)
o 5% Succrose + 1% BSA + 0,5% Tween 20 in 40 mM PBS (pH 7,4) x Sample Pad:
o 5% Succrose + 5 % Dextran + 0,5% Tween 20 + 0,05% Natriumazid
2.1.3 Antikörper
Es werden für die Untersuchungen monoklonale Antikörper eingesetzt, die gegen Parvalbumin aus Kabeljau gerichtet sind. Die Antikörper werden bereits aufgereinigt von der BIOMETEC GmbH Greifswald bezogen. Dabei handelt es sich um die aufgeführten monoklonalen Antikörper:
x Wi 11 – 1G3G11 [3,85 mg/ml] in 0,01% Thiomersal Lot. Ch100111
x Wi 11 – 3G9D5 [2,5 mg/ml] in 0,01% Thiomersal Lot. Ch100111
x Wi 11 – 3D12G7 [1,9 mg/ml] in 0,01% Thiomersal Lot. Ch100111
Außerdem wird der polyklonale Antikörper für die Experimente verwendet:
Host: Goat – Anti [2 mg/ml]
Antigen: Mouse IgG (H+L)
Label: unconjugated
Lot. OE1714962, Thermo Scientific, IL61101, USA
2.1.4 Fischproben
Die Fischproteine werden aus tiefgefrorenem Kabeljau (Lot. L161/3), Alaska Seelachs (Lot. 417/3B) und Hering isoliert. Der Fisch stammt von Frigofood International Sarl 27, Luxemburg.
2.1.5 LFA – Komponenten
Für die Durchführung des Lateral Flow Assay werden die im Anschluss aufgeführten Komponenten eingesetzt, wobei alle Materialen von der Millipore – Corporation, Bedford, MA 01730, USA, stammen:
x Membran:
o HIFLOW Plus 75 Membran; Lot. 0035621 o HIFLOW Plus 090 Membran; Lot. R2PN90542 o HIFLOW Plus 138 Membran; Lot. R2PN90535 o HIFLOW Plus 180 Membran; Lot. R2PN90535 o HIFLOW Plus 240 Membran; Lot. 0050819X07081 x Konjugatpad:
o Glass Fiber Conjugate Pad; Lot. 92083401 x Sample Pad:
o Cellulose Fibre Sample Pad; Lot. 92054701 x Absorbentpad:
o Absorbent Pad GF/DVA 17 x 300 mm; Lot. 580896-2 o Absorbent Pad CF6 27 x 300 mm; Lot. 655959-1
2.1.6 Geräte
Während der Durchführung der Experimente kommen die nachfolgend aufgeführten Gerätschaften zum Einsatz:
x Horizontal – Schüttler (Heidolph Polymax 1040)
x Spektralfotometer (1510 Thermo Scientific Multiskan Go) x Laborzentrifuge (3K30 SIGMA)
x Trockenschrank (Heraeus Instruments UT 20)
x Reinstwassersystem Clear UV Plus (SG Wasseraufbereitung & Regenerierstation) x Vortexer (Heidolph Reax top)
x Magnetrührer (Variomag)
x pH – Meter (pH 720 WTW Series inoLab) x Waage (BP210S Sartorius)
x Universal – Zerkleinerer (KRUPS, Speedy Plus Universal Zerkleinerer)
2.2 Lateral Flow Assay
Die immunchromatographische Methode Lateral Flow Assay wird, wie bereits unter Punkt 1.2.2 beschrieben, auf Grund seiner positiven analytischen und praktikablen Eigenschaften in vielen Anwendungsgebieten eingesetzt. Insbesondere in der Lebensmittelindustrie weckt die Methode
erhöhtes Interesse, da sie als Vor – Ort – Schnelltest zur Erstuntersuchung von Chargen auf Kontaminationen (Allergene, Toxine) eingesetzt werden kann. [33]
2.2.1 Aufbau
Ein Lateral Flow Assay setzt sich generell aus 5 unterschiedlichen Komponenten zusammen, die für die korrekte Funktionalität genau aufeinander abgestimmt sein müssen. Bei den 5 Komponenten handelt es sich um:
1. Sample Pad 2. Konjugatpad 3. Membran
4. Test – und Kontrolllinie 5. Absorbentpad
Anhand von Abbildung 8 soll der allgemeine Aufbau eines LFA – Teststreifen dargestellt und die Funktionen der einzelnen Komponenten näher erläutert werden. [4]
Abbildung 8: Aufbau eines LFA - Teststreifen (www.rapid-diagnostics.org, 05.08.2013)
Das Sample Pad befindet sich über dem Konjugatpad, besteht aus einem papierartigen Material und dient zur Probenfilterung, d. h. es soll sämtliche Feststoffe (Lebensmittelpartikel etc.) zurückhalten, die einen negativen Einfluss auf die Kapillarkräfte ausüben [4]. Des Weiteren dient das Sample Pad als Zwischenspeicher für die Probe, um diese zum Konjugatpad zu befördern und dort gleichmäßig zu verteilen. Des Weiteren besteht die Möglichkeit, dass Sample Pad mit verschiedenen Substanzen, wie z. B. Proteinen, Tensiden, Puffern oder Zuckern, zu
behandeln, um die Flussrate (Flow) zu beeinflussen. Derartige Behandlungen bewirken eine Verbesserung der Probenviskosität oder der Reaktionszeit zwischen Zielanalyten (Antigenen) und dem Antikörper – Nanogoldkomplex auf dem Konjugatpad. [32]
Ein weiterer Bestandteil des LFA ist das Konjugatpad (Conjugate Pad), welches sich unterhalb des Sample Pads befindet und ca. 2 mm überlappend auf der Membran (Nitrocellulose membrane) ist. Das Konjugatpad besteht aus fiberglasartigem Material, auf das der markierte sekundäre Antikörper (Antikörper – Konjugat) aufgetragen wird. Dabei kann das Auftragen des Konjugats entweder über Sprühen erfolgen, was eine wohldefinierte und reproduzierbare Konjugatmenge pro mm² ergibt, oder durch „Baden“ geschehen, was eine unkontrollierte Konjugatmenge pro mm² bewirkt und Intensitätsschwankungen der Test – und Kontrolllinie zur Folge haben kann. [4] Als Antikörper – Marker (Label) wird hauptsächlich kolloidales Gold eingesetzt, gefolgt von gefärbten Latexpartikeln. Außerdem kommen gefärbte Karbon – oder Selenpartikel zum Einsatz, wobei chemilumineszierende oder fluoreszierende Nanopartikel selten verwendet werden. Die kolloidale Stabilität der Nanopartikel in Lösung spielt eine entscheidende Rolle für die Funktionalität des LFA – Teststreifens. Diese wird erreicht, indem die Antikörper auf der Oberfläche der Nanogoldpartikel binden. [32] Die Ursache dafür ist, dass Proteine, insbesondere Antikörper, dazu in der Lage sind, an der Oberfläche der kolloidalen Goldpartikel (Nanopartikel) stark zu adsorbieren, sodass stabile Konjugate gebildet werden können, wobei die Antikörper (Proteine) ihre biologischen Eigenschaften behalten. Die Proteinadsorbtion an der Goldoberfläche ist eine nicht kovalente Bindung, die einerseits auf ionischen Wechselwirkungen zwischen negativ geladenen Nanopartikeln und positiv geladenen Proteinstellen basiert und andererseits durch hydrophobe Anziehungskräfte zwischen dem Protein und der Metalloberfläche zu Stande kommt. Des Weiteren haben koordinative Bindungen zwischen dem Metall und den leitfähigen Stickstoff – und Schwefelatomen der Antikörper (Proteine) einen Einfluss auf die Ausprägung der nicht kovalenten Bindung. Die Problematik bei den sogenannten Biokonjugaten (Nanopartikel – Protein) ist, dass diese auch an anderen Systembestandteilen bzw. Stoffen mit hoher Affinität adsorbieren können und dadurch unerwünschte Bindungen (nicht spezifisch) eingehen. Auf Grund dieser Tatsache werden die Biokonjugate zusätzlich mit „trägen“ (inerten) Makromolekülen, wie z. B. BSA (Bovine Serum Albumin), Gelatine oder Polyethylen Glykol, nach der Adsorption der Antikörper (Proteine) stabilisiert. [34] Weitere wichtige Faktoren für die Konjugatbildung sind die Pufferzusammensetzung, Pufferstärke und der pH – Wert der Lösung sowie die Größe der Nanopartikel, im Falle von kolloidalem Gold 15 – 40 nm [32].
Die Membran ist die zentrale Komponente des LFA und stellt mit den wichtigsten Teil des immunchromatographischen Systems dar, da einerseits auf ihr die Test – und Kontrolllinie immobilisiert sind und andererseits ihre Materialeigenschaften die Signalerzeugung maßgebend beeinflussen. Auf Grund seiner positiven Eigenschaften wird vorwiegend Nitrozellulose als Membranmaterial eingesetzt, wobei auch andere Materialen, wie z. B. Nylon, Polyethersulfon oder Polyethylen zum Einsatz kommen. Eine der vorteilhaften Eigenschaften von Nitrozellulose ist das hohe Vermögen, Proteine (Antikörper) zu adsorbieren. Zunächst sind Wechselwirkungen zwischen den Nitrogruppen (funktionelle Gruppe -NO2) des Polymers und den Carbonylgruppen (funktionelle Gruppe –CO) der Peptidbindung (Protein) ausschlaggebend für die anfängliche Anziehungskraft. Die Adsorption wird anschließend über weitere Wechselwirkungen zwischen der Nitrozellulose und den hydrophoben Proteindomänen verstärkt. Im Fall vom IgG – Antikörper (Kontrolllinie) beträgt die Bindungskapazität z. B. 100 μg/cm², was sehr hoch ist, da in der Regel lediglich 1 – 2 μg/cm aufgetragen werden. Zusätzlich erhält die Nitrozellulose-membran die biologische Aktivität der gebundenen Proteine über einen langen Zeitraum, wobei diesbezüglich Pufferzusammensetzungen einen größeren Einfluss haben. Ein weiterer Vorteil von Nitrozellulosemembranen sind die Oberflächeneigenschaften, da diese sehr glatt (geschmeidig) sind und deshalb die Antikörper der Test – und Kontrolllinie sehr gut aufgetragen werden können. Hingegen bewirken raue Strukturen ein unregelmäßiges Auftragen der Linien auf die Membranoberfläche, sodass eine ungleichmäßige Signalerzeugung während des Tests die Folge sein kann. In der Regel wird das Membranmaterial auf Grundlagen bestehend aus Polypropylen, Polyethylen oder Polystyrol zur Verbesserung der Stabilität und Festigkeit geklebt. Die jeweilige Grundlage hat jedoch keinen Einfluss auf die Reaktionen während der LFA – Durchführung. [35] Ausschlaggebend für die kapillare Fließgeschwindigkeit (s/cm) sprich die Zeit, welche die Flüssigkeitsfront (Probe – Antikörper – Konjugat) benötigt, um sich im Membranmaterial zu bewegen, ist die Porengröße. Diese beeinflusst maßgeblich die Reaktionszeit und somit auch die Sensitivität des Tests [4].
Die Test – und Kontrolllinie sind auf der Membran immobilisiert, wobei die Testlinie vor der Kontrolllinie positioniert wird. Bei der Testlinie handelt es sich um den primären Antikörper (Fänger – Antikörper), der lediglich die Zielanalyten (Antigene) bindet bzw. detektiert, die am sekundären Antikörper (goldmarkierter Antikörper) gebunden sind. Die Positionierung der Testlinie auf der Membran beeinflusst die Leistungsfähigkeit des LFA – Tests, da eine weitere Entfernung der Testlinie vom Sample Pad / Konjugatpad eine längere Reaktionszeit für die Bildung des Antigen – Antikörper (sekundärer) – Nanogoldkomplexes zur Folge hat. Dabei ist zu beachten, dass die Fließgeschwindigkeit mit zunehmender Distanz abnimmt. Die
Kontrolllinie stellt ebenfalls einen Antikörper dar, in der Regel einen IgG – Antikörper, der sämtliche Proteinmoleküle, wie z. B. den goldmarkierten sekundären Antikörper, bindet. Demnach wird anhand der Kontrolllinie die Funktionalität des LFA überprüft. Die letzte Komponente eines LFA ist das Asorbentpad, welches am Ende des Teststreifens, ca. 2 mm membranüberlappend, positioniert ist und den Abtransport der Flüssigkeit übernimmt. Deshalb besteht es hauptsächlich aus mehrschichtiger Cellulose mit einer hohen Saugfähigkeit, sodass viel Feuchtigkeit durch die Kapillarwirkung aufgenommen werden kann. Durch das Vorhandensein eines Absorbentpads kann ein höheres Probenvolumen eingesetzt werden, wodurch sich die Sensitivität verbessert. [32]
2.2.2 Funktionsprinzip
Beim LFA existieren grundsätzlich 2 Funktionsprinzipien, die je nach Anwendungsbereich eingesetzt werden. Das erste Prinzip wird als Kompetitiver LFA bezeichnet, bei dem sich die Signalentwicklung verschlechtert, je höher die Konzentration der Zielanalyten in einer Probe ist. Dabei korreliert die Verschlechterung des Signals mit der Konzentrationszunahme an Zielanalyten. [32] Normalerweise wird dieses Format zur Detektion von Hormonen oder Pestiziden eingesetzt, da diese von geringer molekularer Größe sind. Es existieren jedoch auch derartige Formate zum Nachweis von Allergenen. [4]
Das zweite LFA – Prinzip wird als Sandwich – Format bezeichnet und kommt bei Analyten zum Einsatz, die mehr als ein Epitop für Antigen – Antikörper – Interaktionen besitzen. Es ist ebenfalls Grundlage der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen und wird deshalb näher erläutert. Abbildung 9 soll dabei zur Verdeutlichung der Abläufe im LFA Sandwich – Format dienen.
Abbildung 9: Funktionsprinzip des LFA Sandwich – Formats (www.lequanbio.com, 11.09.2013)
Im ersten Schritt erfolgt die Probenaufgabe auf das Sample Pad, wobei die aufgebebenen Volumina zwischen 150 – 250 μl liegen. Die Probe läuft anschließend durch das Sample Pad zum Konjugatpad, wo sich die goldmarkierten sekundären Antikörper befinden. Diese sind spezifisch gegen ein Epitop des Zielanalyten gerichtet und binden sich an jenen. In diesem Zusammenhang ist die Fließgeschwindigkeit der Flüssigkeit entscheidend, sodass ausreichend Reaktionszeit für die Bindung zwischen sekundärem Antikörper und Antigen vorhanden ist, da der kapillare Fluss durch die Membran sofort nach der Probenaufgabe einsetzt. Des Weiteren muss beachtet werden, dass das Konjugatpad mit der Membran überlappt, sodass der Kapillarfluss überhaupt zu Stande kommt. Im weiteren Verlauf bindet der Antigen – Antikörper – Goldkomplex an den primären Antikörper (Testlinie), der auf der Membran immobilisiert ist und spezifisch gegen ein anderes (freies) Epitop des Zielanalyten gerichtet ist, d. h. die beiden Antikörper (sAK / pAK) konkurrieren nicht um dasselbe Epitop. Dadurch erfolgt die Anlagerung der goldmarkierten Komplexe an die Testlinie, was zur Bildung einer roten Linie führt. Die Signalstärke (Intensität der Färbung) ist direkt proportional zur Antigenkonzentration in der Probe. In diesem Fall ist die Fließgeschwindigkeit erneut ein wichtiger Faktor für die
