Ermittlung optimaler Antikörperpaarkombination

Abbildung 19: Positive Blindwerte (Wdh. Vorversuch - V6)

Als Ursache für die positiven Blindwerte wird zunächst unsauberes Arbeiten vermutet, d. h., dass es zu einer Kreuzkontamination während der Vorbereitung gekommen ist. Im Verdacht stehen dabei die eingesetzten Sample Pads und Konjugatpads, obwohl durch die getrennten Arbeitsplätze und die gewissenhafte Vorgehensweise (regelmäßige Reinigung / Handschuhe / räumliche Trennung) eine Kontamination während der Herstellung fast ausgeschlossen werden kann. Dennoch werden für die Wiederholung LFA – Komponenten einer anderen Herstellungs-charge und ein zusätzlicher Blind – Teststreifen mit Reinstwasser als Probe verwendet, um Kreuzkontaminationen auszuschließen. Eine Kontamination der Pufferlösungen wird von vornherein ausgeschlossen, da diese separat zu den Proben gelagert werden. Die Wiederholung des Versuchs ergibt ebenfalls positive Blindwerte, sodass neue Ansatzpunkte zur Problemlösung gesucht werden.

Der neue Ansatz zur Problemlösung befasst sich mit der Kombination der entsprechenden Antikörperpaare. Dabei wird vermutet, dass der sekundäre Antikörper unkomplexiert, d. h. ohne gebundenes Antigen an den primären Antikörper bindet und in Folge dessen die positiven Blindwerte entstehen. Deshalb werden Versuche durchgeführt, bei denen verschiedene Kombinationen zwischen sekundärem und primärem Antikörper untersucht werden. Dadurch sollte einerseits die Problematik positiver Blindwerte analysiert und andererseits die optimale Antikörperpaarkombination für die Weiterentwicklung des LFA – Verfahrens zum Nachweis des Fischallergens Parvalbumin gefunden werden. Für die Untersuchungen werden die im Vorfeld optimierten Methoden (Siehe Punkt 3.3.1 / 3.3.2) eingesetzt. Die 3 verwendeten Fischproben

werden 10fach mit PB 10 mM verdünnt, wobei für die beiden Blindwerte erneut PB 10 mM und Reinstwasser verwendet wird. Tabelle 6 stellt die untersuchten Antikörperpaarkombinationen dar.

Tabelle 6: Untersuchte Antikörperpaarkombinationen

Versuch Primärer Antikörper Sekundärer Antikörper

1 Wi 11 – 3G9D5 Wi 11 – 1G3G11

2 Wi 11 – 1G3G11 Wi 11 – 3G9D5

3 Wi 11 – 1G3G11 Wi 11 – 3D12G7

4 Wi 11 – 3D12G7 Wi 11 – 1G3G11

5 Wi 11 – 3D12G7 Wi 11 – 3G9D5

6 Wi 11 – 3G9D5 Wi 11 – 3D12G7

Die Untersuchungen zur Optimierung der Antikörperpaarkombinationen zeigen, dass insbesondere die Kombinationen der Versuche 2, 5 und 6 sehr gut harmonieren. Die Antikörperpaarungen liefern eindeutige Signale, wobei es sich bei der V 2 – Kombination um die Antikörperpaarung handelt, die bei den im Vorfeld als optimal beschriebenen Methoden eingesetzt wird. Die Problematik der positiven Blindwerte kann jedoch durch die Experimente nicht gelöst werden, da in allen 6 Versuchen beide Testreifen (PB 10 mM / Reinstwasser) ein positives Testergebnis anzeigen. Dabei wird beobachtet, dass die Testliniensignale der Blindwerte in den Versuchen 1, 3, 4 teilweise stärker sind als die der eigentlichen 3 Fischproben.

Hingegen sind die positiven Blindwerte der Versuche 2, 5, und 6 deutlich schwächer als die Testliniensignale auf den LFA – Streifen mit dem Fischprotein (Parvalbumin). In Abbildung 20 sind die Ergebnisse des Versuchs 2 dargestellt.

Abbildung 20: Antikörperpaarkombination - Versuch 2

Anhand von Abbildung 20 wird ersichtlich, dass insbesondere Kabeljau und Alaska Seelachs sehr starke Signale aufweisen und diese sich deutlich von den schwach positiven Blindwerten unterscheiden. Im Vergleich mit den anderen Fischproben liefert Hering eine sehr schwache Testlinie, wobei dies durch Testschwankungen, z. B. durch unterschiedliche Konjugatqualitäten die sich aus dem Trocknungsprozess ergeben, hervorgerufen werden kann. Die Testlinie entwickelt sich bei den Fischproben annähernd einheitlich innerhalb von 3 Minuten und die Kontrolllinie ist bereits nach 2 Minuten vorhanden, wobei die Intensität über die Zeit unterschiedlich zunimmt. Bei den Blindwerten zeigt sich die Testlinie erst schwach nach 10 Minuten und die Kontrolllinie nach 5 Minuten. Zum Vergleich mit den sehr guten Signalstärken aus den Versuchen 2, 5 und 6 enthält Abbildung 21 einen Vertreter der eher schlechten Antikörperpaarkombinationen (V3).

Abbildung 21: Antikörperpaarkombination - Versuch 3

Anhand von Abbildung 21 ist der Unterschied zum Versuch 2 eindeutig zu erkennen. Es wird ersichtlich, dass die Blindwerte ein stärkeres Testliniensignal erzeugen als die eigentlichen Proben mit dem Fischprotein Parvalbumin. Die Kontrolllinien bilden sich im Versuch 3 nach 3 Minuten annähernd einheitlich. Bei den Testlinien kann erst nach 25 Minuten eine leichte Schattierung auf der Testlinie erkannt werden, die in ihrer Intensität nicht weiter zunimmt.

Auf Grund der guten Signalentwicklung mit der Antikörperpaarkombination V 2 und der guten Erfahrung bei den Vorbereitungen zur LFA – Testdurchführung wird die Paarung in den Folgeexperimenten weiter eingesetzt. Die Untersuchungen zur optimalen Antikörperpaar-kombination können die Problematik der positiven Blindwerte nicht lösen, weshalb eine neue Ursache in Betracht gezogen wird. Dabei wird vermutet, dass die Kombination der behandelten LFA – Komponenten, insbesondere die Membran und das Konjugatpad, nicht optimal aufeinander abgestimmt sind und deshalb Wechselwirkungen zwischen den Reagenzien auftreten. D. h. es wird überlegt, ob das PVP die Membran an der Stelle unzureichend blockt, wo der primäre Antikörper immobilisiert ist, also zwischen den einzelnen primären Antikörpern, und es deshalb zur Anlagerung von BSA kommt, das die freien Bindungsstellen der Nanogoldpartikel blockt. Diese Möglichkeit wird in Betracht gezogen, da sich unmittelbar nach dem die Flow Front über den immobilisierten primären Antikörper zieht, sich eine schwache Schattierung auf der Testlinie bildet und demnach eine Wechselwirkung zwischen den Komponenten definitiv vorhanden ist. Deshalb werden erneut Folgeversuche durchgeführt, um die beteiligten Komponenten dieser Reaktion zu ermitteln. Dabei werden verschiedene Vorbehandlungen der LFA – Komponenten miteinander kombiniert, die einerseits in den Vorversuchen gute Signale entwickelt haben und andererseits noch nicht bei Blind – Testreifen

zum Einsatz gekommen sind. Die unterschiedlichen Kombinationen der LFA – Komponenten sind in Tabelle 7 dargestellt.

Tabelle 7: Folgeversuche zur Antikörperpaarkombination

Versuch Sample Pad Konjugatpad Membran Membrantyp 1 unbehandelt 5% Succrose + 1%

BSA + 0,5% Tween 20 2% Casein HF 240 2 unbehandelt 5% Succrose + 1%

BSA + 0,5% Tween 20

1% BSA + 5%

Succrose HF 240 3 unbehandelt 0,5% BSA + 0,2%

Tween 20

1% PVP + 5%

Succrose HF 240

In den Folgeversuchen zur Antikörperpaarkombination zeigt sich, dass die Kombination aus Versuch 1 keine positiven Blindwerte erzeugt, d. h. die Vorbehandlung der Membran mit 2%

Casein in PBS 100 mM (pH 7,4) für 30 Minuten ist die optimale Methode zum Membranblocken. Dabei wird auf eine anschließende Behandlung der Membran mit 5%

Succrose verzichtet. Zudem ist zu erwähnen, dass die Behandlungsart des Konjugatpads und der Membran von Kolosova (2008) stammt. Es kommt zu keinen Einschränkungen bezüglich der Signalentwicklung und Farbintensität bei den 3 Fischproben (10fach verdünnt), sodass Parvalbumin eindeutig detektiert wird bei negativen Blindwerten (PB 10 mM / Reinstwasser).

Durch die Membranbehandlung mit 2% Casein verlangsamt sich die Geschwindigkeit der Flow Front, sodass mehr Zeit für die Reaktionen (Komplexbildung) zur Verfügung steht. Die Teststreifen sind nach 7 Minuten komplett durchgelaufen (Sample Pad – Absorbentpad), wobei sich die Kontrolllinie einheitlich bei allen LFA – Streifen nach 8 Minuten bildet und in ihrer Intensität nach 20 Minuten am Maximum ist. Die Testlinien bei den 3 Fischproben bilden sich nach 10 Minuten und können nach 15 Minuten als eindeutig positiv eingestuft werden. Hingegen kommt es bei den Blindwerten nach 1h zu keiner Testlinienbildung oder schwachem Schattierungsansatz, sodass diese als eindeutig negativ beurteilt werden. Das Ergebnis des Versuch 1 ist in Abbildung 22 dargestellt, wobei eine Wiederholung des Versuchs 1 die gleichen Ergebnisse bringt. Die in den Versuchen 2 – 3 angewandten Vorbehandlungen sind ungeeignet und führen zu positiven Blindwerten.

Abbildung 22: Folgeversuch 1 - Negative Blindwerte

Anhand der Abbildung 22 wird ersichtlich, dass die Fischproben eindeutig positiv und die Blindwerte eindeutig negativ sind. Auf Basis der gewonnenen Erkenntnisse werden die Versuche zur Ermittlung der LFA – Nachweisgrenze durchgeführt. Die Vorbereitung der Membran wird dahingehend angepasst, dass an Stelle von 1% PVP in PBS 100 mM (pH 7,4) mit anschließender 5% Succrose Behandlung die Membran lediglich für 30 Minuten in 2% Casein (in PBS 100 mM pH 7,4) inkubiert wird, um anschließend bei RT über Nacht zu trocknen. Die Vorbereitung der anderen LFA – Komponenten bleibt unverändert und wird weiterhin nach den unter Punkt 3.3.1 und Punkt 3.3.2 beschriebenen Methoden durchgeführt.