6. Anhang
6.4. Methoden
6.4.6. Offline-Analytik
100 µl Zellprobe wurden 1:1 mit einer 0,4 %igen Trypanblau-Lösung gemischt. Der Farbstoff diffundiert durch die defekte Zellmembran toter Zellen, sodass eine Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen möglich ist. Die Zellsuspension wird in eine Neubauerzählkammer pipettiert und unter einem Phasenkontrastmikroskop (Qlympus bei 200facher Vergrößerung ausgezählt. Um Fehler durch z.B. mangelnde Durchmischung zu minimieren, wurde aus vier Zählungen der Mittelwert gebildet. Die Berechnung der Zellzahl erfolgt nach folgender Gleichung:
1
Aus dem Quotienten der Lebend-Zellzahl und der Gesamtzellzahl wurde die Vitalität [%]
bestimmt.
Glukose-/ Laktatbestimmung
Die Konzentrationen an Glukose und Laktat im Kulturüberstand wurden nach Zellzentrifugation (3 min, bei 400 g) mit dem YSI 2700 SELECT Analyzer (YSI Yellow Springs Instruments, OH, USA) ermittelt.
Aminosäure HPLC
Die Konzentrationen der Aminosäuren Glutamin und Glutamat im Kulturüberstand wurden mittels RP-HPLC (C18 Säule, 5 µm, 3,9x150 mm, Waters Resolve) nach Vorsäulen-Derivatisierung mit Ortho-Phtaldialdehyd (Opa) ermittelt. Probenvorbehandlung: Zur Fällung der unerwünschten Proteine wurden 100 μl zellfreier Kulturüberstand in 400 μl eiskaltes Methanol geträufelt. Durch die Lagerung bei -20 °C für 24 h wurde die Fällung vervollständig. Die gefällten Proteine wurden zentrifugiert (1000 g, 3 min) und der Überstand mit Boratpuffer entsprechend verdünnt (pH 10).
Verwendte Puffer und Lösungen:
• OPA-Reagenz: 270 mg Ortho-Phtaldialdehyd wurde in 5 ml Ethanol aufgelöst. 200 µl Mercaptoethanol wurden zugefügt und mit 0,4 M Boratpuffer (12,36 g Borsäure/500 ml) pH 9,5 auf 50 ml aufgefüllt.
• Eluent A: 13,6 g Natriumacetat-Trihydrat und 12,0 g Natriumdihydrogenphosphat (wasserfrei) wurden in 2 l ddH2O gelöst. 5 ml 10 M NaOH werden zugegeben und mit der NaOH auf pH 7 eingestellt. Die Lösung wurde filtriert. 42 ml THF und 42 ml MeOH werden zugegeben.
• Eluent B: 54 % MeOH und 46 % ddH2O (v/v).
Laufbedingungen: Flussrate 1 ml/min; 30 °C
Detektion: Fluoreszenzdetektor RF-10AxL (Shimadsu, Duisburg) bei Ex 330/ Em 420 nm
Tabelle 6.4.1: Lösemittelgradient für die Aminosäure HPLC.
Zeit [min] Eluent A [%] Eluent B [%]
0 100 0 50 0 100 55 0 100 60 100 0 67 100 0
Bestimmung der Laktatdehydrogenase-Aktivität
Informationen über Zellschädigung lassen sich durch die Bestimmung intrazellulärer Enzyme erhalten, die durch Verletzung der Zellmembran bzw. Zellkompartimente (durch z.B. Scherstress) in das Medium abgegeben werden. Eines der intrazellulären Enzyme ist die Laktatdehydrogenase (LDH), die im Cytoplasma der Zelle vorkommt und nach einer Zellschädigung im Medium nachweisbar ist. Die Bestimmung der LDH-Aktivität im Kulturüberstand gibt einen Hinweis auf den Anteil lysierter Zellen. Die Bestimmung der LDH-Aktivität im Kulturmedium wurde in dieser Arbeit auf zwei verschiedene Arten bestimmt. Die jeweiligen Testprinzipien wurden nachfolgend vorgestellt.
Testprinzip 1
Die Bestimmung der LDH-Aktivität in den Kulturüberständen der CHO-Kultivierungen erfolgte über die Methode der Anfangsgeschwindigkeit. Das Testprinzip beruht auf einer enzymatischen Reaktion. In Anwesenheit von LDH wird NADH zu NAD+ oxidiert, Pyruvat zu Laktat reduziert.
Das Gleichgewicht liegt weit auf der Seite von Laktat und NAD+. Die Geschwindigkeit der NADH-Abnahme wird photometrisch bestimmt und ist der LDH-Aktivität proportional. Messgröße ist die Extinktion bei 340 nm.
Verwendete Puffer und Lösungen:
• 70 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4
• 4 mM Pyruvat-Lösung
• 0,7 mM NADH-Lösung (NADH vor dem Abwiegen auf RT bringen)
Vorbereitung:
• Zentrifugierte Kulturproben dürfen zuvor nicht eingefroren und wieder aufgetaut werden.
• Zwischenlagermöglichkeit bei 2 - 8 °C, maximal 4 Tage.
• Kulturüberstände gegebenenfalls mit Kaliumphosphatpuffer so verdünnen, dass die LDH-Aktivität in einen Messbereich von 20 bis 200 U/L liegt.
• Reaktionslösung: 1:1 Mischung aus Pyruvat- und NADH-Lösung kurz vor Versuchsbeginn täglich frisch in einem Braunglasfläschchen ansetzten und die Lösung im Wasserbad auf 35 °C temperieren.
• Kaliumphosphatpuffer: im Wasserbad auf 35 °C temperieren
• Plattenlesegerät: Spektrophotometer „Multiskan“ auf 32 °C vortemperieren.
Durchführung:
• 50 µl Kulturprobe wurden pro Vertiefung in eine Mikrotiterplatte pipettiert. Als Blindwert dient der Kaliumphosphatpuffer
• Nach dem Auftragen der Proben (mind. Doppelbestimmung) wurde die Mikrotiterplatte in den auf 32 °C vortemperierten Plattenlesegerät gelegt.
• Schütteln der Mikrotiterplatte für 2 min bei 32 °C.
• 150 µl Kaliumphosphat-Puffer (35 °C) in die Vertiefung der Mikrotiterplatte geben.
• Schütteln der Mikrotiterplatte für 2 min bei 32 °C.
• 100 µl der Reaktionslösung (35 °C) in die Vertiefung der Mikrotiterplatte geben.
• 3 s schütteln und Kinetik starten (Messintervall alle 10 s über einen Zeitraum von 170 s)
Berechnungsgrundlage der Enzymaktivität in U/L:
[
1 1]
Vgesamt: Gesamtvolumen [ml]ε : mikromolarer Extinktionkoeffizient (NADH = 0,63 ml · mol-1 · cm-1) d : Schichtdicke 0,857 cm
∆ t: Zeitintervall [min]
VProbe: Probenvolumen [ml]
Die Messung wird in der Auswertung berücksichtigt, wenn
• E0 (Probe) ≥ ca. 70 % E0 (Blindwert)
• Steigung pro Minute ≤ -0,00075 (geringere Steigungen deuten auf LDH-Aktivität unter-halb der Bestimmungsgrenze hin)
• Die Korrelation der linearen Extinktionsabnahme sollte ≥ 0,998 sein
Testprinzip 2
Die Bestimmung der LDH-Aktivität in Kulturüberständen der Hybridom-Zellen während der Aufreinigung über Sartobind® Direct Einheiten erfolgte anhand eines kolorimetrischen Tests (LDH Cytotoxicity detection kit, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim). Das Testprinzip beruht ebenfalls auf der enzymatischen Umwandlung von Laktat zu Pyruvat durch Reduktion von NAD+ zu
NADH/H+. In einer zweiten Redoxreaktion wird NADH/H+ wieder zu NAD+ oxidiert. Die freien H+-Ionen werden auf das gelbfarbene Tetrazoliumsalz übertragen. Dadurch wird dieses zu einem rotfarbenen Formazansalz reduziert. Diese Farbbildung wird nach einem Zeitraum von 30 min durch eine photometrische Messung bei einer Wellenlänge von 490 nm gemessen. Die Menge an gebildetem Formazansalz ist proportional zur der Anzahl an lysierten Zellen. Je höher die LDH-Aktivität, desto intensiver die Färbung. Die Proben wurden für die Analyse 1:2 verdünnt, sodass die gemessene Absorption unterhalb einer Absorptionseinheit (AU) lag. Die Durchführung erfolgte nach Herstellerangaben.
Für die Bestimmung einer Kalibrationsgeraden wurden verschiedene Konzentrationen eines LDH-Standards in Kulturmedium (Gibco™ Hybriodma-SFM, Invitrogen, Karlsruhe) angesetzt. Die eingesetzten Konzentrationen lagen in einem Aktivitätsbereich des Enzyms von 0,5 bis 50 U/l. Die Standardkonzentrationen wurden nach Herstellerangaben (LDH Cytotoxicity detection kit) vermessen. Durch die Auftragung der Aktivität gegen die gemessene Absorption ergibt sich ein linearer Zusammenhang (siehe Abbildung 6.4.1). Die unbekannte LDH-Aktivität in den Kulturüberständen kann anhand der gemessenen Absorption bei 490 nm über die ermittelte Geradengleichung bestimmt werden.
• LDH-Standard: rabbit muscle L-LDH (Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz)
y = 38,823x + 0,0475 R2 0,998
0 10 20 30 40 50 60
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
AU [490 nm]
LDH-Aktivität [U/L]
Abbildung 6.4.1: Kalibrationsgerade für die Bestimmung der LDH-Aktivität.
Korrelation der Zellzahl zur LDH-Aktivität
Für eine Korrelation der Zellzahl zur LDH-Aktivität wurden verschiedener Zellkonzentrationen (0,1·106; 0,5·106; 1,0·106; 1,5·106 Zellen/ml) verwendet. Die Zellsuspensionen unterschiedlicher Konzentration (Dreifachbestimmung) wurden für einen Zeitraum von 2 h in einem Thermoschüttler bei 400 min-1 und 37 °C in Lysis-Puffer inkubiert. Ein Zeitraum von 2 h gewährleistet unter den gewählten Bedingungen eine komplette Lyse der Zellen, ohne dass die Enzymaktivität beeinträchtigt wird. Nach erfolgter Zelllyse wurden die Proben bei 400 g für 3 min zentrifugiert.
Die Proben wurden so verdünnt, dass die gemessen Absorption unterhalb einer AU lag. Für die Bestimmung der LDH-Aktivität im Überstand wurde nach erfolgtem kolorimetrischen Test (Testprinzip 2) die Absorption bei 490 nm bestimmt. Unter Berücksichtigung der vorherigen Probenverdünnung ergibt sich durch die Auftragung der relativen Absorption gegen die gewählte Zellzahl ein linearer Zusammenhang (vgl. Abbildung 6.4.2).
Lysis-Puffer: 2 % Triton X 100 in Zellkulturmedium
y = 1E-05x - 1,1245 R2 0,9776
0 5 10 15 20 25
0,0E+00 4,0E+05 8,0E+05 1,2E+06 1,6E+06
Zellen/ml
relative AU [490 nm]
Abbildung 6.4.2: Maximal detektierbare LDH-Aktivität nach kompletter Zelllyse verschiedener Zellkonzentrationen. Verwendeter kolorimetrischer Test: LDH Cytotoxicity detection kit (Roche), Messung der Absorption bei 490 nm.
Für die Bestimmung der maximal möglichen LDH-Aktivität bei kompletter Lyse einer bestimmten Zellzahl kann anhand der ermittelten Geradengleichung aus Abbildung 6.4.2 zunächst die theoretische Absorption bei 490 nm ermittelt werden. In einem zweiten Schritt kann die ermittelte Absorption mit Hilfe der Geradengleichung aus Abbildung 6.4.1 in die LDH-Aktivität
umgerechnet werden. Die auf diese Weise erhaltene Aktivität entspricht der bei einer bestimmten Zellzahl maximal möglichen LDH-Aktivität bei kompletter Zelllyse.
Maus IgG-ELISA
Die Bestimmung des IgG-Gehalts im Kulturüberstand der Hybriom-Zellen erfolgt anhand eines spezifischen Maus-IgG ELISA (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim). Die Proben wurden für die Analyse in einem Verhältnis 1:500 mit Blocking-Puffer verdünnt. Die Durchführung erfolgte nach Herstellerangaben.