Bindungsverhalten aus zellfreier Lösung

Um die Bindungseigenschaften des Antikörpers an der Protein A Membran genauer zu untersuchen, wurden Adsorptionsisothermen unter statischen Bedingungen mit der reinen Protein A Membran aufgenommen. Hierfür wurden verschiedene Konzentrationen einer IVIg-Lösung in Bindungspuffer angesetzt. Anhand der ermittelten Isotherme wurde die maximale statische Bindungskapazität sowie die Dissoziationskonstante bestimmt, die das Maß für die Affinität des Antikörpers zur Protein A Membran darstellt. Darüber hinaus wurde die zeitabhängige Adsorption des Antikörpers an der Membran untersucht.

Bestimmung der Adsorptionsisotherme

Die Protein A Membran wurden mit einem Locheisen (Innendurchmesser: 20 mm) ausgestanzt.

Die Membranstanzlinge der Fläche 3,14 cm² wurdenin 6-Lochplatten überführt und für 2 min mit Bindungspuffer äquilibriert. Nach der Äquilibrierung wurden die Stanzlinge in neue 6-Lochplatten überführt und mit je 3 ml einer IVIg-Lösung ansteigender Konzentration überschichtet. Die Inkubation erfolgte für 24 h bei Raumtemperatur (RT) auf einem Laborschüttler bei 400 min^-1. Die Versuche wurden für jede Konzentration in Dreifachbestimmung durchgeführt. Die verbleibende Antikörperkonzentration in den Überständen wurde mittels UV-Messung bei 280 nm bestimmt.

Die an der Membran gebundene Antikörpermenge ergibt sich aus der Differenz der IVIg-Konzentration im Überstand vor und nach der Inkubation pro cm² Membranfläche. Durch die Auftragung der adsorbierten Menge IVIg pro cm² gegen die dazugehörige IVIg-Gleichgewichts-konzentration im Überstand wird eine Adsorptionsisotherme erhalten. [196]

Die Ergebnisse zeigten starke Schwankungen in den Konzentrationsverläufen der adsorbierten Antikörpermenge für die jeweilige Ausgangskonzentration. Darüber hinaus wurde keine einheitliche Membransättigung beobachtet. Der mittlere Fehler der Antikörperadsorption über den gesamten Konzentrationsbereich lag bei 14 %. Im Rahmen der Diplomarbeit von Andrea Mönster stellte sich in weiterführenden Versuchen heraus, dass die Protein A Membran Inhomogenitäten in der Ligandendichte aufweist. Es konnte gezeigt werden, dass diese Inhomogenitäten ausschlag-gebend für den großen Fehler und die starken Schwankungen in den Konzentrationsverläufen waren.

Um die Membraninhomogenitäten auszugleichen wurden in darauf folgenden Versuchen statt einem drei Membranstanzlinge pro Vertiefung einer 6-Lochplatte (9,42 cm² Membranfläche) verwendet und die oben beschriebene Durchführung in einer Dreifachbestimmung wiederholt. Das Gesamtvolumen der Antikörperlösung pro Vertiefung sowie das Verhältnis von angebotener Antikörpermenge zur Membranfläche entspricht den Angaben der ersten Versuchreihe. Die Konzentration der jeweiligen Antikörperlösung für die Beladung der Membran und das daraus resultierende Masse-Fläche-Verhältnis von Antikörper zu Membran sind in Tabelle 4.4.1

dargestellt. Durch die Auftragung der adsorbierten Menge IVIg pro cm² gegen die dazugehörige IVIg-Gleichgewichtskonzentration im Überstand wird die in Abbildung 4.4.2 gezeigte Adsorp-tionsisotherme erhalten.

Tabelle 4.4.1: Vorschrift für die Antikörperbeladung der Protein A Membran für die Aufnahme der Adsorptionsisotherme. [196]

Der mittlere Fehler der Antikörperadsorption über den gesamten Konzentrationsbereich wurde durch den Ausgleich der Inhomogenität der Membran auf 4 % reduziert. Eine Membransättigung von 0,184 mg/cm² wurde annähernd bei einem angebotenen Masse-Fläche-Verhältnis von 0,318 mg/cm² erreicht.

Abbildung 4.4.2: Bindungsverhalten des Antikörpers an der Protein A Membran. Adsorptions-isotherme nach Langmuir. [196]

Ausgehend von der Funktion einer Langmuir-Isotherme lässt sich anhand der ermittelten Daten eine Regressionsisotherme berechnen, die den Verlauf nach Langmuir widerspiegelt (siehe Abbildung 4.4.2). Auf Grundlage dieser lassen sich die maximale statische Bindungskapazität Q_max der Protein A Membran sowie die Dissoziationskonstante KDiss, nach der im Anhang 6.5.2 beschrieben Vorgehensweise, berechnen.

Die maximale statische Bindungskapazität der Protein A Membran beträgt demnach 0,192 mg/cm². Die Dissoziationskonstante des Protein A-Antikörper-Komplexes beträgt 2,2·10^-7 mol/l und liegt in einem Bereich der für starke Affinitätswechselwirkung in der Literatur beschrieben ist (10^-5-10^-7 mol/l). [26]

Antikörperadsorption als Funktion der Zeit

Wie die Ergebnisse im vorherigen Abschnitt gezeigt haben, wurde bei einem angebotenen Masse-Fläche-Verhältnis von 0,637 mg/cm² die maximale Bindungskapazität innerhalb 24 h erreicht.

Demzufolge wurden die Versuche zur Bestimmung der zeitabhängigen Adsorption des Antikörpers bei diesem Masse-Fläche-Verhältnis durchgeführt. Die Durchführung der Versuche erfolgte wie im vorherigen Anschnitt beschrieben. Die Inkubation der Membranstanzlinge in der Antikörperlösung erfolgte für 24 h auf einem Laborschüttler bei 400 min^-1. Die Versuche wurden in einer Dreifach-bestimmung durchgeführt. Zu Beginn der Inkubationszeit erfolgte die Probenahme (10 µl) aus der Reaktionslösung in kurzen Zeitabständen. Eine letzte Probe wurde nach 24 h Inkubationszeit entnommen. Die Antikörperkonzentration in den Proben wurde über eine UV-Messung bei 280 nm bestimmt (siehe Anhang 6.4.15).

Die Proteinstabilität ist oftmals abhängig von der Umgebungstemperatur. Frisch angesetzte protein-haltige Lösungen werden in der Regel bei 4 °C gelagert, um die biologische Aktivität des Proteins aufrechtzuerhalten. Um den Einfluss der Temperatur auf die Antikörperadsorption zu untersuchen, wurde die Geschwindigkeit der Antikörperbindung an der Membran sowohl bei RT als auch bei 4 °C ermittelt. Die gebundene Antikörpermenge pro Membranfläche wurde zum jeweiligen Zeitpunkt der Probenahme bestimmt. Abbildung 4.4.3 zeigt den zeitlichen Verlauf der Antikörper-adsorption bei RT und 4 °C. In Tabelle 4.4.2 sind die Ergebnisse der Adsorption als Mittelwerte einer Dreifachbestimmung nach 20 min, 2 h und 24 h dargestellt.

Die Verläufe der Antikörperadsorption an der Protein A Membran sind unabhängig von der gewählten Temperatur annähernd identisch. In beiden Fällen wurde nach zweistündiger Inku-bationszeit die maximale Bindungskapazität von 0,182 ±0,021 mg/cm² erreicht. Im Hinblick auf einen möglichst produktschonenden Aufreinigungsprozess konnte gezeigt werden, dass eine niedrigere Temperatur keinen negativen Einfluss auf die Geschwindigkeit der Adsorption des Antikörpers ausübt. Um einem möglichen Stabilitätsverlust der Antikörperlösung während der Aufreinigung vorzubeugen kann diese ohne zeitlichen Verlust bei 4 °C durchgeführt werden.

0,00 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,24

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Zeit [h]

IVIgads [mg/cm²]

Adsorption bei 4°C Adsorption bei RT

Abbildung 4.4.3: Antikörperadsorption an der Protein A Membran als Funktion der Zeit bei 4 °C und RT. [196]

Tabelle 4.4.2: Beladung der Protein A Membran nach 20 min, 2 h und 24 h bei RT und 4 °C.

Temperatur RT 4°C

0,102 ± 0,013 0,091 ± 0,009

Beladung [mg/cm ] nach²

0,183 0,022± 0,182 0,020±

0,185 0,025± 0,189 0,012±

20 min 2 h 24 h

Fazit

Die Untersuchungen der Bindungseigenschaften des Antikörpers aus zellfreier Lösung an einer Protein A Membran zeigten, dass diese Membran für eine Produktisolierung geeignet ist. Die nach Langmuir ermittelte Dissoziationskonstante demonstriert das hohe Maß an affiner Wechselwirkung des Antikörpers mit den Protein A Liganden der Membran (K_Diss 2,2·10^-7 mol/l). Die hohe maximale statische Bindungskapazität bestätigt den Einsatz dieser Membran für die nachfolgende Anwendung in den neuartigen Membranadsorber-Modulen zur direkten Aufreinigung des Antikörpers. Um die Stabilität des Antikörpers während der Aufreinigung sicherzustellen, könnte diese anstatt bei Raumtemperatur ebenso auch bei 4 °C ohne Zeitverlust durchgeführt werden.