2.9 Inhibitoren der TGT
3.1.2 Oberfl¨ achen-Plasmon-Resonanz-spektroskopische Untersuchungen 33
MANT 12
Abb. 3.2 N-Methylanthranils¨aure (MANT) und die fluoreszenzmarkierte Chinazolinon-Verbindung 12.
und Ligand ein ausreichend langes Zwischenst¨uck (
”Spacer“) angebracht werden muss.
Dies geht vermutlich mit einem erh¨ohten Ki-Wert des fluoreszenzmarkierten Liganden einher.
3.1.2 Oberfl¨ achen-Plasmon-Resonanz-spektroskopische
immobilisieren und die Wechselwirkungen mit einem kleinen Liganden in der mobilen Phase zu messen [Markgren et al., 1998, 2000; Karlsson et al., 2000].
Von Usami et al. [2002] wurde einen Testsystem zur Messungen der Bindung von Li-ganden an den Estrogen-Rezeptor entwickelt, dass auf der SPR-Spektroskopie beruht.
Dazu wurde Estrogen auf einem Chip immobilisiert. ¨Uber diesen Chip wurde eine L¨ o-sung, die den Estrogen-Rezeptor sowie den Analyten in verschiedenen Konzentrationen enth¨alt, gesp¨ult. Aus den so erhaltenen Sensogrammen konnten die Kd-Werte der Li-ganden ermittelt werden.
In Anlehnung an dieses Testsystem wurde versucht, einen Bindungsassay f¨urZ. mobilis TGT aufzubauen. Dazu sollte ebenfalls ein Ligand auf einem Goldchip mit einem ge-eignetem Anker (
”Linker“) immobilisiert werden. Als Ligand wurde Guanosin gew¨ahlt.
Guanosin ist ein Baustein der tRNA. Bestimmte tRNAs, die Guanin in der wobble position enthalten, sind Substrate der TGT (Kapitel 2.6.3). Vermutlich bindet dieses Guanin in dieselbe Bindetasche wie preQ1. Bisher ist es nicht gelungen, die Struktur derZ. mobilis TGT im Komplex mit Guanin, Guanosin, Guanosinmonophosphat oder tRNA aufzukl¨aren. Deshalb ist der Bindungsmodus des Guanins, der Ribose sowie der daran angekn¨upften Phosphatgruppen nicht bekannt. Modellierungen inMolochaben aber gezeigt, dass die Phosphatgruppen vermutlich aus der preQ1-Bindetasche heraus-ragen. In der tRNA sind die 3’- und 5’-OH-Gruppen der Ribose mit Phosphatgruppen verestert. Diese beiden Position eignen sich deshalb, um ¨uber einen
”Spacer“ einen
” Lin-ker“ anzubringen. Eine Synthese zum Anbringen eines biotinylierten
”Linkers“ an die 5’-Position von Adenosin-Derivaten wurde von Golisade et al. [2001] beschrieben. Mit dem Biotinyl-Rest kann die Verbindung dann auf einen kommerziell erh¨altlichen mit Streptavidin beladen Goldchip ¨uber die sehr affine Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung aufgebracht werden.
Analog zu dieser Synthese wurden von C. Herforth (Arbeitsgruppe Prof. A. Link, Phil-ipps Universit¨at Marburg) Derivate des Guanosins synthetisiert (Tab. 3.1). Durch die Lage der Bindetasche und der From der TGT bedingt, muss der Abstand zwischen Guanosin und Biotin mindestens 14 ˚A betragen, um einen sterischen Konflikt zwischen dem auf dem Chip immobilisierten Streptavidin und der TGT zu vermeiden (Abb.
3.3). Die
”Linker“ der synthetisierten Guanosin-Derivate haben eine L¨ange von ca. 14 (14), 18 (15), 24 (16) und 23 ˚A (17). Durch die
”Linker“ wird die Affinit¨at dieser Verbindungen zur TGT nicht wesentlich beeinflusst. Im Vergleich zu Guanosin (13, Ki = 5,0 µM) sind die Ki-Werte mit Ki = 7,6 - 13 µM nur leicht erh¨oht.
Tab. 3.1 Liste der biotinmarkierten Guanosin-Derivate.
Nr. Verbindung Ki [µM ] Nr. Verbindung Ki [µM ]
13 5,0 ±3,1 16 13± 2
14 7,6 ± 0,1 17∗) 9,3 ±2,8
15 11± 7
∗) Diese Verbindung enth¨alt ein Gemisch aus Biotin und Biotinsulfoxid.
Verbindung15wurde erfolgreich auf einen Streptavidin-Chip von BIAcore aufgebracht.
Es konnte aber ¨uber einen Zeitraum von 30 Minuten keine Bindung der TGT beob-achtet werden. Um zu testen, ob eventuell der
”Linker“ zu kurz gew¨ahlt wurde, wurde versucht, die Verbindung mit dem l¨angsten
”Linker“ in dieser Serie (17) auf einen Chip aufzubringen. Dies gl¨uckte leider nicht. Ein Grund hierf¨ur k¨onnte sein, dass die Ver-bindung z. T. Biotinsulfoxid anstelle von Biotin enth¨alt. Dieses besitzt eine niedrigere Affinit¨at zu Streptavidin als Biotin.
Abb. 3.3 Um einen sterischen Konflikt zwischen dem auf dem Chip immobilisierten Streptavidin und der TGT zu vermeiden, muss die L¨ange des
”Linkers“ min-destens 14 ˚A betragen.
3.1.3 Zusammenfassung und Ausblick
Der bisher verwendete Assay beruht auf dem Einsatz von radioaktiv markiertem Gua-nin. Dadurch ist er sehr kostspielig und zeitaufw¨andig. Zudem wird tRNA ben¨otigt.
Deshalb sollte ein alternatives Testsystem, das m¨oglichst ohne tRNA auskommt, ent-wickelt werden.
Sowohl mit Fluoreszenz- als auch mit Oberfl¨ achen-Plasmon-Resonanz-spektrosko-pischen Methoden ist es bisher nicht gelungen, die Bindung von Liganden an die TGT zu messen.
Im Falle der Fluoreszenz-Untersuchungen kann dies darauf zur¨uckgef¨uhrt werden, dass bisher noch kein geeigneter fluoreszenzmarkierter Ligand gefunden wurde. Der hier ver-wendete Fluorophor (Anthranils¨aure) hat den Vorteil, dass er sehr klein ist und deshalb gut in die Bindetasche der TGT passt. Allerdings ¨uberlappt sein Fluoreszenzspektrum zu stark mit dem des verwendeten Chinazolinon-Grundk¨orpers, so dass keine Fluores-zenzunterschiede nach der Bindung gemessen werden konnten. Andere oft verwendete Fluorophore haben den Nachteil, dass sie relativ groß sind. Werden diese an einen Liganden angekn¨upft, geht das vermutlich mit einer unerw¨unschten Verminderung der Affinit¨at einher.
F¨ur SPR-spektroskopische Untersuchungen konnte das mit Biotin markierte Guanosin-Derivat 15 auf einen BIAcore-Chip aufgebracht werden. Allerdings konnte auch hier keine Bindung mit der TGT detektiert werden. Um eine Aussage treffen zu k¨onnen, ob durch SPR-Untersuchungen mit Guanosin-Derivaten eine TGT-Bindung prinzipiell messbar ist, m¨ussen weitere
”Linker“ getestet werden, bzw. die vorhanden
”Linker“ mit Biotin anstelle von Biotinsulfoxid markiert werden.
Zudem ist die Frage zu kl¨aren, ob das Ziel, einen tRNA-freien Assay zu entwickeln, ¨ uber-haupt theoretisch machbar ist. Nicht eindeutig gekl¨art ist, ob die tRNA-Bindung vor der Bindung des Inhibitors erfolgen muss. Um dies n¨aher zu untersuchen, sollten ent-weder isothermale titrationskalorimetrische (ITC) oder weitere SPR-spektroskopische Untersuchungen durchgef¨uhrt werden. F¨ur die SPR-spektroskopischen Untersuchungen bietet es sich an, tRNA(-Fragmente) zu immobilisieren und die TGT-Bindung an diese zu messen. Falls durch die Ligandbindung die tRNA-Bindung unterdr¨uckt wird, k¨onnte auch darauf aufbauend ein neues Testsystem entwickelt werden.