2.9 Inhibitoren der TGT
3.1.1 Fluoreszenzspektroskopische Untersuchungen zur Bestimmung
kann, kann umgangen werden, wenn anstelle der Enzymreaktion nur die Bindung bzw.
Dissoziation des Liganden gemessen wird.
Aus den eben angef¨uhrten Gr¨unden sollte deshalb ein Bindungsassay f¨ur Inhibitoren der Z. mobilis TGT entwickelt werden. Idealerweise sollte dieser Assay ohne tRNA auskommen.
3.1.1 Fluoreszenzspektroskopische Untersuchungen zur
deren Mikroumgebung ver¨andert, was wiederum Auswirkungen auf ihre Fluoreszenzei-genschaften hat.
In der Bindetasche der Z. mobilis TGT befindet sich Tyr106 (Abb. 2.7 auf Seite 18).
In der apo-Form verschließt die Seitenkette dieser Aminos¨aure die Bindetasche durch Wasserstoffbr¨ucken zu Asp156 und Gln203. Nach der Ligandbindung werden diese Was-serstoffbr¨ucken ge¨offnet. Der Aromat von Tyr106 geht dann eine π-Wechselwirkungen zum Liganden ein. Dadurch wird die direkte Umgebung des Tyrosin durch die Bindung stark ver¨andert. Dies geht mit hoher Wahrscheinlichkeit mit einer ¨Anderung der Fluo-reszenzeigenschaften einher. Allerdings ist die Quantenausbeute von Tyrosin geringer als die von Tryptophan. Da die Z. mobilis TGT vier Tryptophane enth¨alt, w¨urde eine Anderung der Fluoreszenzeigenschaften von Tyrosin vermutlich im Rauschen unterge-¨ hen. Aus diesem Grund wurde in einer vorangegangen Arbeit Tyr106 zu Tryptophan mutiert [Gr¨adler, 2000]. In dieser Arbeit wurde auch gezeigt, dass die Y106W-Variante der TGT ¨ahnliche kinetische Parameter wie das Wildtyp-Enzym besitzt.
Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurde versucht, die Bindungskonstanten von Inhibitoren der TGT mit diesem mutierten Protein zu bestimmen. Dazu wurde sowohl der Ligand mit dem Enzym titriert als auch umgekehrt. In beiden F¨allen konnte keine Anderung der Fluoreszenzintensit¨¨ at gemessen werden.
Ein Grund hierf¨ur k¨onnte sein, dass die Seitenkette von Trp106 im Gegensatz zur Sei-tenkette von Tyr106 sowohl vor als auch nach der Ligandbindung keinen definierten Bindungsmodus einnimmt [Gr¨adler, 2000]. Demnach ist die Umgebungs¨anderung die-ser Aminos¨aure bei der Bindung geringer als urspr¨unglich erwartet. Zudem besitzt die Y106F-TGT zus¨atzlich zum mutierten Trp106 noch vier weitere Tryptophane. Die ma-ximale ¨Anderung betr¨agt also etwa 25 % vom Ausgangswert. Außerdem besitzen alle bekannten Liganden ein aromatisches System. Das f¨uhrt dazu, dass sie selbst bei der Anregungswellenl¨ange des Tryptophans Licht absorbieren. Dieser so genannte
”innere Filter-Effekt“ muss rechnerisch oder experimentell ausgeglichen werden [Birdsall et al., 1983].hier sowieso nur ein kleiner Unterschied in der Fluoreszenz¨anderung zu erwarten war, kann es sein, dass das Messsignal im Rauschen untergegangen ist.
Es ist auch denkbar, dass unter den verwendeten Bedingungen keine Bindung statt-findet. Es wurde zwar derselbe Puffer wie bei den kinetischen Messungen verwendet (Kapitel 5.2.8.2), aber keine tRNA zugesetzt. Bis heute ist nicht gekl¨art, ob vor der Ligandbindung zun¨achst tRNA gebunden haben muss oder ob der Ligand auch ohne tRNA ohne Affinit¨atsverlust bindet. Das Absorptionsmaximum von tRNA liegt bei 260 nm. Da diese im ¨Uberschuss zugesetzt werden muss, ist die Absorption der tRNA
bei 280 nm so hoch, dass die durch den inneren Filter-Effekte die Proteinfluoreszenz komplett gel¨oscht wird. Deshalb kann durch Messung der Proteinfluoreszenz der Ein-fluss der tRNA auf die Bindung nicht untersucht werden.
3.1.1.2 ¨Anderung der Fluoreszenz des Liganden
Aus den selben Gr¨unden wie auf Proteinseite kann es auch bei der Bindung eines Ligan-den zur ¨Anderung dessen Fluoreszenz kommen. Ist der Kd-Wert eines fluoreszierenden Liganden bekannt, so kann durch eine Verdr¨angungstitration dieses Liganden durch einen (nicht fluoreszierenden) Liganden mit unbekannten Kd-Wert dessen Bindungs-konstante ermittelt werden (siehe z. B. Epps et al. [1999]).
Der Grundk¨orper der in Kapitel 3.5 vorgestellten Chinazolinone fluoresziert. Verbin-dung 56 (Tab 3.14 auf Seite 89) besitzt Anregungsmaxima bei 240, 270 und 360 nm sowie ein Emissionsmaximum bei 460 nm (Abb. 3.1). Um einen inneren Filter-Effekt durch TGT zu vermeiden (Absorption bei ca. 280 nm), wurde f¨ur die Messungen mit diesem Liganden eine Anregungswellenl¨ange von 360 nm gew¨ahlt. Aber auch hier konn-te nach Titration des Enzyms mit Ligand und vis versa keine ¨Anderung der Fluoreszenz gemessen werden. Die Anregungswellenl¨ange von 360 nm erlaubte es, dass den Mes-sungen tRNA zugef¨ugt werden konnte. Aber auch dies hatte keinen Einfluss auf die Fluoreszenz.
Eine m¨ogliche Erkl¨arung w¨are, dass die ¨Anderung der Fluoreszenz relativ klein ist und daher im Rauschen untergeht. Deshalb wurde an den Chinazolinon-Grundk¨orper ein Fluorophor angekn¨upft, der sensibel auf Umgebungs¨anderungen reagieren sollte.
Ein bekannter sehr kleiner Fluorophor ist N-Methylanthranils¨aure (MANT, Abb. 3.2) [Molecular-Probes]. Das Anregungsmaximum dieser Verbindung betr¨agt 356 nm, das Emissionsmaximum liegt bei 448 nm. Nach der Bindung an ein Protein nimmt die Fluoreszenzquantenausbeute zu und das Emissionsmaximum wird um 10 - 20 nm in den k¨urzer welligen Bereich verschoben.
Modellierungen mitMoloc[Moloc] haben jedoch gezeigt, dass ein Chinazolin, an das der MANT-Rest angebracht worden ist, vermutlich nicht das aktive Zentrum der TGT binden kann. Die N-Methylgruppe w¨urde wahrscheinlich aus sterischen Gr¨unden st¨oren.
Deshalb wurde auf sie verzichtet. Die von E. Meyer (ETH Z¨urich) synthetisierte Verbin-dung (12, Abb 3.2) besitzt einen Ki-Wert von 1,5 ±0,3 µM. Die Inhibitionskonstante
Abb. 3.1 Fluoreszenzspektren von 12 (Abb.3.2) und 56 (Tab. 3.14 auf Seite 89).a - c) Anregungsspektren; d - f) Emissionsspektren a) Anregungsspektrum von12, gemessen bei einer Emissionswellenl¨ange von 390 nm (Slit 5 und 10 nm). b), c) Anregungsspektren von 56 (b) und 12 (c), gemessen bei einer Emissionswellenl¨ange von 456 nm (Slit 3 und 5 nm). b) Emissionsspektrum von12, gemessen bei einer Anregungswellenl¨ange von 308 nm (Slit 5 und 10 nm). b), c) Emissionsspektren von 56 (b) und 12 (c), gemessen bei einer Anregungswellenl¨ange von 350 nm (Slit 5 und 10 nm). Die Fluoreszenzeigenschaften des Anthranils¨aureresters von 12 uberlagern sich mit denen des Chinazolinon-Grundk¨¨ orpers.
Die Fluoreszenzintensit¨at der Anthranils¨aureresters ist geringer als die des Chinazolinon-Grundk¨orpers.
f¨allt damit in einen f¨ur einen Verdr¨angungsassay akzeptablen Bereich. Fluoreszenz-spektroskopische Untersuchungen von 12 haben aber ergeben, dass die Fluoreszenzin-tensit¨at der Anthranils¨aure geringer ist als die des Chinazolinon-Grundk¨orpers (Abb.
3.1). Die vorteilhaften Eigenschaften der Anthranils¨aure werden deshalb von den Fluo-reszenzeigenschaften des Grundk¨orpers ¨uberdeckt. Auch mit dieser Verbindung konnte folglich keine TGT-Bindung gemessen werden.
Eine m¨ogliche Alternative w¨are es, den MANT-Fluorophor an einen anderen Grund-k¨orper (Kapitel 3.4 und 3.7) anzuf¨ugen, dessen Fluoreszenzeigenschaften sich nicht mit denen des MANT-Restes ¨uberlagern.
Anstelle eines anderen Grundk¨orpers k¨onnte auch ein anderer Fluorophor verwendet werden. Allerdings sind andere h¨aufig f¨ur solche Zwecke eingesetzte Fluorophore (z. B.
Fluorescein oder BODIPY) sterisch sehr anspruchsvoll, so dass zwischen Grundk¨orper
MANT 12
Abb. 3.2 N-Methylanthranils¨aure (MANT) und die fluoreszenzmarkierte Chinazolinon-Verbindung 12.
und Ligand ein ausreichend langes Zwischenst¨uck (
”Spacer“) angebracht werden muss.
Dies geht vermutlich mit einem erh¨ohten Ki-Wert des fluoreszenzmarkierten Liganden einher.