Dihydropyridazinochinolintrione

Wie in Kapitel 3.3 beschrieben, brachte ein Screening in der NovoNordisk Compound Database (NNCD) verschiedene Pyridazindione hervor (Tab. 3.5 auf Seite 46). Die bei-den affinsten Verbindungen waren20 und21mit Ki = 5,0 bzw. 4,7µM. Durch Eindif-fundieren der Verbindungen in Protein-Kristalle sowie durch Kokristallisationsans¨atze konnte leider keine Struktur der TGT im Komplex mit den beiden Liganden erhal-ten werden. Aufgrund des aufgekl¨arten Bindungsmodus von Inhibitor 18, der ebenfalls durch dieses Screening gefunden wurde, l¨asst sich aber ihr Bindungsmodus plausibel modellieren (Abb. 3.7 auf Seite 49). Ligand20 kann in der Bindetasche der TGT mit 18 so ¨uberlagert werden, dass beide Pyridazindion-Einheiten dieselben Wechselwir-kungen zum Protein eingehen und das Stickstoffatom des Pyridinonrings von 20 sich an der gleichen Position befindet wie ein Stickstoffatom des Imidazolrings von18. Die-ses kann dann ebenfalls eine Wasserstoffbr¨ucke mit dem Wassermolek¨ul W1 eingehen.

Folglich liegt die gleiche R¨uckgrat-Konformation an Leu231 und Ala232 vor, wie sie auch in der Kristallstruktur von TGT·18gefunden wurde. Der Bindungsmodus von21 ist wahrscheinlich analog zu dem f¨ur20 postulierten.

Das Ergebnis einer

”Hot Spot“-Analyse (Kapitel 5.4.1) der Bindetasche der TGT mit einer Wasserstoffbr¨ucken-Donor-Sonde ist in Abb. 3.15 gezeigt. Die Donorgruppen von 20befinden sich im modellierten Bindungsmodus in als g¨unstig berechneten Bereichen.

Zus¨atzlich weist die Analyse bisher nicht adressierte Donor-Felder in der N¨ahe von Asp102 und Asp280 auf. Durch Modifikation des Grundk¨orpers mit Substituenten, die mit diesen Asparagins¨auren wechselwirken k¨onnen, wurde versucht, die Affinit¨at von 20 zu steigern.

Eine Synthese von 20 ist in Luo & Castle [1991] beschrieben. F¨ur eine Optimierung ist aber der Thiophenring in20 aus zwei Gr¨unden ungeeignet. Zum einen k¨onnen aus chemischen Gr¨unden an das Schwefelatom selbst keine Reste angebracht werden. Zum anderen k¨onnen Reste, die an dem zum Schwefelatom benachbarten C2-Kohlenstoff angebracht werden (Abb. 3.16), durch die Geometrie des 5-Rings bedingt, nicht die Bindetasche im Bereich der beiden interessanten Aspartate erreichen, sondern ragen oberhalb davon aus der Tasche heraus. Deshalb wurde zun¨achst der Thiophenring

Abb. 3.15

”Hot Spots“ berechnet mit DrugScore f¨ur eine Wasserstoffbr¨ ucken-Donor-Sonde (N.3).Die Wasserstoffbr¨ucken-Donoren von20liegen in als g¨unstig berechneten Bereichen. Zus¨atzlich befinden sich

”Hot Spots“ im Bereich von Asp102 und Asp280 (kon-turiert auf 80 (gr¨unblau), 84 (blau) und 88 % (violett)).

bioisoster durch einen Phenylring ersetzt (Abb. 3.16). Die Affinit¨at im Vergleich zur Ausgangsverbindung (K_i= 5,0µM) blieb dabei mit 3,7µM innerhalb der Fehlergrenzen unver¨andert. Zur Dekoration stehen nun die Positionen 8 und 9 von32 zur Verf¨ugung.

20 32 33

Abb. 3.16 Schema, nach dem versucht wurde, die Leitstruktur 20 zu optimieren.Zus¨ atz-lich angegeben sind dieKi-Werte der Verbindungen.

Diese Verbindung wurde durch eine Abwandlung der in Luo & Castle [1991] beschrie-benen Synthese erhalten. Als Edukt wurde Anthranils¨aure anstelle von Aminothio-phencarbons¨aure eingesetzt (Abb. 3.17). Durch die Verwendung von Anthranils¨ aure-Derivaten, die in 5- oder 6-Position substituiert sind, k¨onnen substituierte Dihydro-pyridazinochinolintrione erhalten werden. Zur Einf¨uhrung von Variationen in die Leit-struktur wurde deshalb in der ACD nach Anthranils¨aure-Derivaten gesucht, die eine

geeignete Gruppe f¨ur weitere Verkn¨upfungen in den in Frage kommenden Positionen besitzen.

Abb. 3.17 Synthese-Schema zur Darstellung von 32 und dessen Derivaten.

Als geeignetes Derivat wurde 2-Aminohydroxybenzoes¨aure gefunden. W¨ahrend die 2-Amino-6-hydroxybenzoes¨aure synthetisch nur sehr aufw¨andig zug¨anglich ist, ist 2-Amino-5-hydroxybenzoes¨aure kommerziell erh¨altlich. Dieses Edukt konnte erfolgreich zu33(Abb. 3.16) umgesetzt werden. Die so erhaltene Verbindung besitzt bereits einen K_i-Wert von 0,7 µM. Ihre Hydroxylgruppe kann nun dazu dienen, verschiedene Res-te anzubringen. Etwas nachRes-teilig bei dieser SynthesestraRes-tegie ist allerdings, dass die Einf¨uhrung von Substituenten bereits auf der Stufe des Hydroxyanthranils¨aureesters erfolgen muss, also auf der zweiten Stufe der Synthese.

Dihydropyridazinochinolintrion-Derivate

Modellierungen mitSybyl[SYBYL] und Moloc[Moloc] haben gezeigt, dass von der Hydroxylgruppe in 33 ausgehend mit einem CH₂-CH₂-NH-Fragment der

”Hot Spot“

im Bereich von Asp280 (Abb.3.15) erreicht werden kann. Direkt benachbart zu die-ser polaren Aminos¨aure befindet sich eine lipophile Tasche, die aus Val45, Leu68 und Val282 gebildet wird. Bei der Optimierung von 33 wurde deshalb versucht, durch ge-eignete Substituenten sowohl eine Wasserstoffbr¨ucke mit Asp280 auszubilden, als auch die lipophile Tasche zu f¨ullen. Die entworfenen Liganden sind in Tab. 3.8 aufgef¨uhrt.

Tab. 3.8 Strukturbasiert entworfene Dihydropyridazinochinolintrione.

Nr. Verbindung K_i [µM ]

34 polymerisiert

35 9,4 ±0,1

Mit Verbindung 34 sollte zun¨achst das Design-Konzept ¨uberpr¨uft werden, ob mit ei-nem CH₂-CH₂-NH-Fragment der

”Hot Spot“ bei Asp280 adressiert werden kann. Ver-bindung35 sollte zus¨atzlich die lipophile Tasche ausf¨ullen. Der Pyrrolidinrest in dieser Verbindung war zuvor schon zuvor schon als m¨oglicher Substituent zur Optimierung der Dihydrophthalazindione aufgefallen (Abb. 3.14).

Bei der Darstellung von 34 zeigte sich aber, dass diese Verbindung unvorhergesehen-erweise polymerisierte. Vermutlich reagiert die aliphatische Aminogruppe mit der Ke-togruppe des Pyridinonrings. Diese Verbindung stand demnach zur Testung nicht zur Verf¨ugung.

Von 35 konnte keine Kristallstruktur im Komplex mit Z. mobilis TGT erhalten wer-den. Der modellierte Bindungsmodus ist in Abb. 3.18 gezeigt. In diesem Bindungsmo-dus nimmt die Seitenkette des Liganden nach Berechnungen mitMimumba¹ [Klebe &

Mietzner, 1994] energetisch g¨unstige Torsionswinkel an (Tab. 3.9). Die Seitenkette geht vermutlich mit dem Stickstoff der Pyrrolidingruppe eine Wasserstoffbr¨ucke zu Asp280 ein. Der pK_a-Wert dieser Gruppe betr¨agt 11,35 [Perrin, 1965]. Deshalb kann davon ausgegangen werden, dass diese Gruppe unter den Assay-Bedingungen (pH 7,3) proto-niert vorliegt. Somit sollte die Verbindung eine ladungsunterst¨utzte Wasserstoffbr¨ucke zu Asp280 ausbilden.

1Mimumbaist ein Programm zur Generierung von biologisch relevanten Konformationen. Es beruht auf der statistischen Analyse von kleinen Molek¨ulstrukturen, die in der CSD gespeichert sind.

Abb. 3.18 Modellierter Bindungsmodus von 35.Das Stickstoffatom der Pyrrolidingruppe be-findet sich in einem mit DrugScore als g¨unstig f¨ur Wasserstoffbr¨ucken-Donoren vor-hergesagten Bereich (konturiert auf 80 (gr¨unblau), 84 (blau) und 88 % (violett)). Im modellierten Bindungsmodus geht dieses Atom eine Wasserstoffbr¨ucke zu Asp280 ein. Die aliphatischen Kohlenstoffe des Restes f¨ullen die lipophile Tasche aus, die aus Val45, Leu68 und Val282 gebildet wird.

Der K_i-Wert von 35 betr¨agt nur 9,4 µM. Vom Modell her kann nicht unmittelbar abgeleitet werden, warum durch die Seitenkette die Affinit¨at im Vergleich zu 32 (K_i = 3,7 µM) nicht gesteigert werden konnte. F¨ur Beitr¨age von ladungsverst¨arkten Wasserstoffbr¨ucken zur Affinit¨at eines Liganden werden Werte von -10 bis -20 kJmol⁻¹ angegeben. Das entspricht einer bis zu 3000fachen Affinit¨atssteigerung [B¨ohm & Klebe, 1996; Davis & Teague, 1999; Gohlke & Klebe, 2002]. Allerdings sind diese Werte stark von der Umgebung abh¨angig. Die Beitr¨age von vergrabenen Wasserstoffbr¨ucken sind wesentlich h¨oher als von oberfl¨achenexponierten. Bei Asp280 handelt es sich um eine gut Wasser zug¨angliche Aminos¨aure. Um den vorgeschlagenen Bindungsmodus ein-zunehmen, muss außerdem ein Wassermolek¨ul, das zu Asp280 eine Wasserstoffbr¨ucke ausbildet, verdr¨angt werden. Das sollte entropisch g¨unstig sein, kann aber enthalpisch ung¨unstig werden, da die ladungsunterst¨utzte Wasserstoffbr¨ucke des Wassermolek¨uls zu Asp280 zun¨achst gel¨ost werden muss. Zudem gibt es Hinweise darauf, dass Asp280 mechanistisch als generelle S¨aure-Base fungiert (Jeffrey Kittendorf, pers¨onliche Mittei-lung). Die Aufgabe von Asp280 w¨are es dann, w¨ahrend der Katalyse das freigesetzte Guanin zu protonieren und preQ₁ zu deprotonieren. Asp280 w¨urde folglich ¨ uberwie-gend protoniert vorliegen (Abb. 2.5 auf Seite 15). Ist dies tats¨achlich der Fall, w¨are der pK_a-Wert von Asp280 im Vergleich zum durchschnittlichen pK_a-Wert von Aspar-taten deutlich erh¨oht. Rechnungen zur Vorhersage vonpK_a-Werten k¨onnen dies jedoch

Tab. 3.9 Torsionswinkel, die die Seitenkette von 35 im modellierten Bindungsmodus einnimmt, im Vergleich zu g¨unstigen Torsionswinkeln, die in Kristallstruktu-ren kleiner Molek¨ule gefunden wurden. Der jeweils energetisch g¨unstigste Winkel ist unterstrichen. (Berechnet mitMimumba[Klebe & Mietzner, 1994]).

Torsionswinkel modellierter Bindungsmodus

energetisch bevorzugt C.sp³(Methylen)-O.sp³

-C.ar(8)-C.ar(9)

-4° ±180°, ±105°,

±75°, 0° C.sp³(C2’)-C.sp³

(Methylen)-O.sp³-C.ar(8)

-95° -180°, ±90° O.sp³-C.sp³

(Methylen)-C.sp³(C2’)-N.sp³

67° ±180°, ±60°

nicht best¨atigen (Ingo Dramburg, pers¨onliche Mitteilung). Diese Rechnungen wurden allerdings ohne tRNA durchgef¨uhrt, da deren Bindungsmodus nicht bekannt ist. Es ist denkbar, dass erst durch die tRNA-Bindung der pK_a-Wert dieser Aminos¨aure ver¨ an-dert wird.

Bei den angestellten ¨Uberlegungen ist einige Vorsicht geboten, weil der Bindungsmo-dus von 35 nicht experimentell bestimmt werden konnte. Denkbar w¨are auch, dass die Pyrrolidingruppe nicht in die Bindetasche zu Asp280 hineinragt, sondern aus ihr heraussteht. Eine ¨ahnliche Seitenketten-Konformation wurde f¨ur Verbindung 65 (Tab. 3.17 auf Seite 104), die ebenfalls eine geladene Aminogruppe besitzt, gefunden (Abb. 3.39 auf Seite 107).

Eine ¨Uberpr¨ufung, ob sich eventuell der lipophile Teil der Pyrrolidingruppe nega-tiv auf die Bindungsenergie auswirkt, war mit dem Dihydropyridazinochinolintrion-Grundk¨orper nicht m¨oglich, weil die entsprechende Verbindung (34) polymerisierte.

Deshalb wurde nach einem chemisch weniger reaktiven Grundger¨ust gesucht.