A NHANG

7.1 Messung, Rauschen und Validierung

7.1.1 Messung

Ein Messvorgang liefert als Ergebnis den Wert einer Messgröße mit einer Einheit, die sich aus dem internationalen System der Einheiten (SI-System) ableiten lässt. Die Messgröße ist eine Eigenschaft des Messobjekts, welche nach einem definierten Verfahren in reproduzier-barer Weise von einem Messinstrument quantifiziert wird.

Prinzipiell beeinflusst jeder Messvorgang das Messobjekt und damit das Ergebnis der Mes-sung. Die Beeinflussung ist aber meist vernachlässigbar klein. Nicht vernachlässigbare Be-einflussungen des Messobjekts durch den Messvorgang können zu systematischen Fehlern führen. Ist die Art und Stärke der Beeinflussung bekannt, kann der systematische Fehler korrigiert werden.

Jeder Messvorgang wird weiterhin beeinflusst durch unkontrollierbare Störungen auf das Messobjekt, den Messvorgang und das Messinstrument. Sie führen zu einer Streuung der Messwerte. Zur Ermittlung eines genauen Ergebnisses wird daher die Messung mehrfach durchgeführt und aus den Werten dieser Stichprobe mit statistischen Verfahren der Werte-bereich bestimmt, der mit einer vorgegebenen Wahrscheinlichkeit den wahren Wert der Messgröße beinhaltet.

7.1.2 Rauschen

In der Mess- und Signaltechnik bezeichnet man die durch unkontrollierbare Einflüsse verur-sachten Streuungen der Messwerte als Rauschen. Rauschen beinhaltet alle jene Anteile am Signal, die keine brauchbare Information enthalten. Es sind daher durchweg unerwünschte Anteile. Andererseits lassen sich aus der Amplitudenverteilung, dem Frequenzspektrum, dem zeitlichen Verlauf und der Abhängigkeit äußerer Einflüssen auf die Rauschquelle neue Informationen gewinnen. Rauschen kann viele Ursachen haben. Einige wichtige sind hier mit ihren Eigenschaften aufgeführt.

1) Thermisches Rauschen (Johnson Noise). Durch die zufällige Bewegung von Ladungs-trägern (Elektronen, Atome, Moleküle) in einem Leiter entstehen zufällige Spannungs-schwankungen unterschiedlichster Frequenzen. Ein Widerstand, wichtiges Bauteil vieler elektronischer Messinstrumente, ist also eine Rauschspannungsquelle. Die Höhe der maximalen Rauschleistung, die diese Quelle abgeben kann, ist proportional zur abso-luten Temperatur und in jedem Frequenzintervall fester Breite gleich groß (weißes Rau-schen): ∆P = ∆fkT (P: Rauschleistung, f: Frequenz in Hertz, k: Boltzmann-Konstante

Messung, Rauschen und Validierung Kapitel 7.1

k = 1.38·10^-23 Ws/K, T: absolute Temperatur in Kelvin). Da die Gesamtleistung (∆f = ∞) nicht unendlich groß werden kann, ist dies nur eine Näherung. Die spektrale Leistungsdichte muss bei großen Frequenzen kleiner werden. Sie ist aber konstant in dem Frequenzbereich, in dem üblicherweise messtechnische Signale vorkommen. Bei Raumtemperatur nimmt sie nach dem Planckschen Strahlungsgesetz erst bei etwa 1GHz deutlich ab.

2) Quantisierungsrauschen. Bei der Digitalisierung eines analogen Signals können die Abweichungen zwischen dem Wert des analogen und des digitalen Signals bis zur Hälfte einer Stufenhöhe betragen. Das Quantisierungsrauschen enthält im Wesentli-chen die Abtastfrequenz und deren Oberschwingungen.

3) Netzbrummen. Die wird bewirkt durch eine induktive oder kapazitive Ankopplung des elektrischen Versorgungsnetzes (50 Hz). Wenn hinreichend lange Zeitreihen von Ein-zelmessungen vorliegen, lässt sich der Einfluss des Netzbrummens durch eine Fourier-Analyse bestimmen und eliminieren.

7.1.3 Validierung

Wie kann man nun sicher sein, dass bei einer Messung wirklich die gesuchte Größe ge-messen wurde? Wie nahe kommt der Messwert dem tatsächlichen Wert der Größe? Maß-nahmen zur Lösung dieser Probleme nennt man Validierung. Dabei ermittelte Größen sind Validierungs-Parameter (validation parameters). Zur besseren Übersicht lassen sie sich ein-teilen in:

1) Parameter bezüglich eines Wertes

Diese Größen beschreiben die Beziehung eines oder mehrerer Messwerte zum zugehö-rigen, tatsächlichen (aber meist unbekannten) Wert.

Richtigkeit (accuracy). Mit dem Begriff „Richtigkeit“ wird beschrieben, ob die Messwer-te um den tatsächlichen, den richtigen bzw. wahren Wert streuen. Sind nur zufällige Schwankungen vorhanden, wird man erwarten, dass mit zunehmender Anzahl an Mes-sungen der Mittelwert sich immer mehr dem richtigen Wert nähert. Der Abstand dieser beiden Werte (absolut oder relativ) ist die Richtigkeit. Eine hohe Richtigkeit kann mit großer oder kleiner Streuung (Präzision) erreicht werden.

Präzision (precision). Die Präzision ist ein Maß für die Streuung der einzelnen Mess-werte um ihren Mittelwert. Zur Angabe wird häufig die Standardabweichung verwendet oder es wird ein Intervall angegeben, in dem der nächste Messwert mit einer bestimm-ten Wahrscheinlichkeit anzutreffen sein wird (z. B. 95%). Größere Wahrscheinlichkeibestimm-ten führen dabei auch zu größeren Intervallen. In der Präzision steckt keine Aussage über die Richtigkeit. Die Präzision lässt sich bezüglich der folgenden Wiederholungsbedin-gungen unterscheiden:

Messung, Rauschen und Validierung Kapitel 7.1 i) Wiederholbarkeit (repeatability): ein Labor und ein Experimentator, kurzer

Zeitab-stand

ii) Reproduzierbarkeit (reproducibility): anderes Labor, Gerät oder Experimentator Selektivität (specificity, selectivity). Manche Messergebnisse sind davon abhängig, ob z.B. andere Substanzen oder andere Verfahrensverläufe vorhanden sind oder sich die Werte anderer Größen geändert haben. Die Selektivität gibt an, wie stark das Ergebnis von anderen Einflüssen abhängig ist, ob also auch nur die zu messende Größe gemes-sen wird. Manchmal wird auch der Begriff "Querempfindlichkeit" verwendet.

2) Parameter bezüglich eines Verfahrens

Diese Größen beschreiben Möglichkeiten und Grenzen von Messungen nach einem bestimmten Verfahren.

Empfindlichkeit (sensitivity). Die Empfindlichkeit einer Messung ist durch die Nach-weisgrenze sowie die Erfassungsgrenze gegeben (s.u.).

Auflösung (resolution). Ein Maß für die Auflösung einer Messung ist durch die Be-stimmungsgrenze gegeben (s.u.).

Linearität (linearity). Die Linearität gibt an, wie sich die Genauigkeit und Präzision von Messungen in Abhängigkeit von dem Wert der Messgröße verhalten.

Hysterese (hysteresis). Von einer Hysterese spricht man, wenn der Endwert einer sich einstellenden Größe von der Richtung abhängt, aus der die Einstellung erfolgt. Dann ist die Zuordnung von Eingangs- und Ausgangsgröße eines Systems nicht mehr eindeu-tig. Hysterese tritt z. B. bei mechanischen Vorgängen mit Spiel (Getriebe, Zeiger-Anzeige), bei magnetischer Ummagnetisierung oder bei mechanischer Belastung im nichtelastischen Bereich auf.

Messbereich (range). Der Messbereich ist das Intervall für die Eingangsgröße, inner-halb derer bestimmte Eigenschaften (Fehler, Stabilität) garantiert werden. Der Anzeige-bereich kann größer als der MessAnzeige-bereich sein. Mit I.D.L. (Instrumental Device Limit) wird die Grenze bezeichnet, die sich allein aus den Grenzen des Meßsystems ohne Be-rücksichtigung von Proben- oder Verfahrensunsicherheiten ergibt.

Nachweisgrenze (limit of detection). An der Nachweisgrenze (ein Wert der Merkmals-größe) erhält man einen Wert der Signalgröße, der mit 50%iger Wahrscheinlichkeit von der zu messenden Größe stammt, genauso gut aber durch zufällige Schwankun-gen verursacht sein kann. Unterhalb der Nachweisgrenze sind weder qualitative noch quantitative Aussagen möglich.

Erfassungsgrenze (limit of quantification). Oberhalb der Erfassungsgrenze ist die Wahrscheinlichkeit für ein zufälliges Signal dieser Größe gering (z.B. kleiner als 1 %).

Zwischen Nachweis- und Erfassungsgrenze kann qualitativ, oberhalb der Erfassungs-grenze quantitativ gemessen werden.

Nichtparametrische Splines Kapitel 7.2

Bestimmungsgrenze. Quantitative Aussagen können auch oberhalb der Erfassungs-grenze nur mit einer gewissen Unsicherheit (Fehler) gemacht werden. Die Bestim-mungsgrenze legt einen Merkmalswert fest, oberhalb dessen der Fehler kleiner als eine festgelegte Schranke (z.B. 5 %) ist.

Robustheit (robustness, ruggedness). Die Robustheit beschreibt bei Messprozessen die Unempfindlichkeit gegenüber Störeinflüssen, welche genau beschreibbar sein müssen.

Bei Produktionsprozessen wird eine stabile Ausgangsgröße gefordert. Dort wird mit Ro-bustheit auch die Unempfindlichkeit gegenüber Schwankungen der Eingangsgröße be-schrieben.

7.2 Nichtparametrische Splines

Als Splines wurden die ursprünglich im Schiffsbau verwendeten flexiblen Holzplanken be-zeichnet, die an bestimmten Punkten fixiert wurden, während sie sich dazwischen frei bie-gen durften. Im mathematischen Sinne handelt es sich bei Splines um eine Funktion s(x), die in einem Intervall (a;b) stückweise aus einfachen Polynomen zusammengesetzt ist, wo-bei eine vorgegebene Anzahl ihrer Ableitungen aller Punkte im Intervall (a;b) kontinuierlich sind. Der Vergleich zu den Schiffsplanken ergibt sich insbesondere dadurch, dass die Poly-nome durch die gegebenen Stützpunkte oder Knoten (die zu interpolierenden Datenpunkte xi/yi) festgelegt sind und ihr Verlauf so angepasst wird, dass die Übergänge der Steigungen (s’) und Krümmungen (s’’) in den Stützpunkten wie bei einer gebogenen Holzplanke konti-nuierlich sind und die Gesamtkrümmung minimal ist. Um eine Kontinuität der Krümmun-gen im Spline zu erreichen, müssen die zusammengesetzten Polynome mindestens dreimal differenzierbar, also dritten Grades, sein. Aus diesem Grund werden zumeist kubische Spli-nes verwendet, die wie folgt definiert sind:

( ) _{i i i i}

s x = + ⋅ + ⋅a b x c x²+ ⋅d x³ Gl. 7.1 wobei xi mit i = 1…n die Lage der Knoten beschreibt und xi ≤ x < xi+1 gilt.

Aus den Kontinuitätsbedingungen der Funktionswerte sowie der ersten beiden Ableitungen ergeben sich folgende Einschränkungen:

i i i i i i i i i i i i i i

i i i i i i i i i i

i i i i i i

a b x c x d x a b x c x d x b c x d x b c x d x

c d x c d x

− − − −

− − −

− −

+ + + = + + +

+ + = + +

+ = +

2 3 2 3

1 1 1 1

2 2

1 1 1

1 1

2 3 2 3

2 6 2 6

(Funktionswerte)

(Steigungen bzw. 1.Ableitungen) (Krümmungen bzw. 2.Ablleitungen) Eine weitere Bedingung ist dadurch gegeben, dass das Spline eine definierte Gesamt-krümmung aufweisen soll. Dazu wird das Integral der quadrierten zweiten Ableitung vorge-geben:

( )

^{s′′ =w}

∫

^{2 Gl. 7.2}

Begriffsdefinitionen Kapitel 7.3 Für den Grenzfall w = w_max geht das Spline zwingend durch die angegebenen Knoten, während sich für w = 0 die Regressionsgerade durch die Knotenpunkte ergibt. In diesem Fall wird die Summe der Abweichungsquadrate

∑ (

yi−s x

( )

i

)

² maximal. Ein Spline, wel-ches die Summe der Abweichungsquadrate minimiert, dabei aber noch eine hinreichende Gesamtkrümmung aufweist, um einem nichtlinearen Datenverlauf lokal folgen zu können, lässt sich unter Einführung eines Glättungsparameters p durch folgende Bedingung ermit-teln:

( ) (

i

( )

i

) ( ) ( )

R p = ⋅p

∑

y −s x ² + −¹ p ⋅

∫

s x′′ ^{2 Gl. 7.3} Über den Parameter p wird so eine Verbindung hergestellt zwischen der Summe der Feh-lerquadrate und der lokalen Krümmung. Diejenige Spline-Funktion s(x), welche R(p) für ei-nen gegebeei-nen Wert von p minimiert, wird als glättender kubischer Spline bezeichnet.

Eine genaue Herleitung der Spline-Funktion, das Lösungsverfahren von Gl. 7.3 sowie die programmtechnischen Umsetzungen sind in verschiedenen Artikeln über Numerische Ma-thematik ^214,215 und Statistik ³¹¹ ausführlich beschrieben und diskutiert.

7.3 Begriffsdefinitionen

Tab. 7-1 Begriffserklärungen zu Programmierung und RT-PCR-Experimenten.

Begriff Erklärung

Datentyp Der Datentyp bestimmt die Art und Weise, wie Daten im Speicher des Rechners abgelegt werden und vom Prozessor interpretiert werden. Wichtige fundamentale Datentypen sind u. a. Wahrheitswerte (Boolean), Ganzzahlen (Integer), Fließkomma-werte (z. B. Single) und Zeichenketten (String). Pascal erlaubt die Definition eigener Datentypen. Konventionsgemäß beginnen die Typenbezeichner mit einem T, z. B.

TMeinTyp.

Eigenschaft Eigenschaften (properties) stellen Schnittstellen zu den Daten, z. B. den Feldern einer Klasse, dar. Die Werte von Eigenschaften können von der Klasse indirekt über den Aufruf entsprechender Methoden geändert oder bestimmt werden. Es können auch nur-lesen-Eigenschaften definiert werden, deren Werte von außerhalb des Objekts nicht geändert werden können.

Ereignis Ein Ereignis (event) kann von einem Objekt ausgelöst werden, nachdem das Objekt eine Aktion durchgeführt hat. Dazu wird die zugewiesene Ereignisbehandlungs-methode aufgerufen. Andere Teile des Programms können auf das Ereignis reagie-ren, indem sie der Ereignis-Eigenschaft die Methode zuweisen, in welcher der dann auszuführende Code steht.

Experiment Die Durchführung einer PCR mit dem LightCycler. Das Ergebnis eines Experiments sind die vom LightCycler erstellten Dateien.

Im Dokument Entwicklung real-time-PCR-basierter Methoden für die moderne DNA-Analytik (Seite 195-200)